本發(fā)明涉及一種黑蘭愈傷細(xì)胞的制備與懸浮培養(yǎng)的方法，屬于工業(yè)生物。
背景技術(shù)：
1、黑蘭（cymbidium?kanran）是蘭科蘭屬草本植物，外形優(yōu)美，富含維生素、醛類和羥酸類物質(zhì)，具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
2、黑蘭植株對(duì)培養(yǎng)條件要求苛刻，容易受氣候和病蟲害的影響，難以大規(guī)模獲得。為緩解植物資源緊缺，解決黑蘭市場(chǎng)需求大等問(wèn)題，植物愈傷細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有著較好的應(yīng)用潛能，該技術(shù)能利用愈傷細(xì)胞的全能性使其再生成植株或生產(chǎn)活性代謝物。這種技術(shù)的前提是要制備黑蘭愈傷細(xì)胞并建立液體懸浮培養(yǎng)體系。但是關(guān)于黑蘭愈傷細(xì)胞制備的相關(guān)報(bào)道較少。
3、外植體的選擇是成功制備愈傷細(xì)胞的基礎(chǔ)，目前愈傷細(xì)胞的制備大多選取植物的葉片、莖段和花，不同外植體的細(xì)胞分裂能力和再生潛力存在明顯差異，直接影響愈傷組織的產(chǎn)生。研究表明植物花蕊的活性物質(zhì)較多，且不易染菌，是一種較好的愈傷誘導(dǎo)外植體。但關(guān)于采用黑蘭花蕊來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織的研究較少。
4、鑒于此，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N黑蘭愈傷細(xì)胞的制備及懸浮培養(yǎng)的方法，以彌補(bǔ)上述不足。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供一種黑蘭愈傷細(xì)胞的制備與懸浮培養(yǎng)方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)外植體的篩選最終確定采用花蕊作為愈傷組織的誘導(dǎo)體，愈傷組織出愈率為88.6%，可懸浮培養(yǎng)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率為68.6%-92.2%，為大規(guī)模培養(yǎng)黑蘭細(xì)胞提供了狀態(tài)良好的愈傷組織。
2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種黑蘭愈傷細(xì)胞的制備與懸浮培養(yǎng)的方法，包括如下步驟：
3、將黑蘭植株消毒后，取不同部位的外植體，接入ph值為5-7的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為20-30℃暗培養(yǎng)（無(wú)光照）條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)15-21天，即得到黑蘭胚性愈傷組織，其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由ms基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、蔗糖25-35g/l、瓊脂6-7g/l、6-ba?1.0-2mg/l、naa?0.5-1.5mg/l、2,4-d?0.3-1.0mg/l和椰子水0.5-1.5g/l組成的營(yíng)養(yǎng)水溶液。
4、本發(fā)明的原理是：黑蘭植株的任何外植體誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生的出愈率不同，不是所有外植體都能誘導(dǎo)出愈傷組織，且誘導(dǎo)出的愈傷組織中可懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷組織的效率也不同。本發(fā)明采用黑蘭植株，通過(guò)篩選誘導(dǎo)外植體，優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，使黑蘭愈傷細(xì)胞的出愈率高，得到胚性愈傷細(xì)胞的形成率高，細(xì)胞的可懸浮培養(yǎng)性強(qiáng)。
5、本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，由ms基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、6-ba、naa、2,4-d和椰子水組成。其中，ms基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基提供植物細(xì)胞生長(zhǎng)必須的無(wú)機(jī)鹽及營(yíng)養(yǎng)元素；蔗糖提供植物細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源；瓊脂作為凝固劑，以便愈傷組織細(xì)胞能夠進(jìn)行表層生長(zhǎng)繁殖；6-ba用作分裂激素；naa用作生長(zhǎng)激素；2,4-d用作生長(zhǎng)激素；椰子水可以促進(jìn)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)，幫助胚性愈傷細(xì)胞的產(chǎn)生。本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)黑蘭愈傷細(xì)胞的形成，得到松散型的胚性愈傷組織細(xì)胞，建立液體懸浮培養(yǎng)體系。
6、在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
7、進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)外植體選用的是黑蘭的花蕊。
8、進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由ms基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、6-ba1.5mg/l、naa?0.5mg/l、2,4-d?0.5mg/l、和椰子水1.5g/l組成。
9、采用上述進(jìn)一步的有益效果是：所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用上述組成，更加有利于誘導(dǎo)黑蘭外植體形成胚性愈傷組織細(xì)胞。
10、進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph值為6，所述溫度為25℃，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為18天。
11、進(jìn)一步，所述黑蘭細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基由ms基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、蔗糖30g/l、6-ba1.5mg/l、naa?0.5mg/l、2,4-d?0.5mg/l、和椰子水1.5g/l組成。
12、進(jìn)一步，所述懸浮培養(yǎng)的黑蘭細(xì)胞濕重和干重在第7天達(dá)到峰值。
13、名詞解釋
14、6-ba，即6-芐氨基嘌呤，是對(duì)人、畜安全的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
15、naa，即萘乙酸，是一種生長(zhǎng)素類似物，作用與植物生長(zhǎng)素相似。
16、2,4-d，即2,4-二氯苯氧乙酸，是一種生長(zhǎng)素類似物，對(duì)誘導(dǎo)愈傷形成有促進(jìn)作用。
17、本發(fā)明的有益效果是：
18、（1）本發(fā)明通過(guò)對(duì)外植體的篩選最終確定采用花蕊作為愈傷組織的誘導(dǎo)體，愈傷組織出愈率為88.6%，可懸浮培養(yǎng)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率為68.6%-92.2%，為大規(guī)模培養(yǎng)黑蘭細(xì)胞提供了狀態(tài)良好的愈傷組織。
19、（2）本發(fā)明開(kāi)發(fā)了黑蘭胚性可懸浮培養(yǎng)愈傷組織細(xì)胞生成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，得到了松散型的胚性愈傷組織細(xì)胞，建立了細(xì)胞的懸浮液態(tài)培養(yǎng)體系。
20、（3）本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，市場(chǎng)前景廣闊，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
1.一種黑蘭愈傷細(xì)胞的制備與懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黑蘭愈傷細(xì)胞的制備的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、6-ba?1.5mg/l、naa?0.5mg/l、2,4-d?0.5mg/l、和椰子水1.5g/l組成的營(yíng)養(yǎng)水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種黑蘭愈傷細(xì)胞的制備與懸浮培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph值為6，溫度為25℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為18天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黑蘭愈傷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)繼代周期為7天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黑蘭愈傷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)的方法，其特征在于，用于培養(yǎng)黑蘭愈傷細(xì)胞。