本申請(qǐng)屬于基因工程技術(shù)與合成生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種反向調(diào)控香草酸基因電路控制系統(tǒng)的方法和香草酸基因電路控制系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
1、香草酸(vanillic?acid，va)是植物體內(nèi)天然的一種酚香類(lèi)的化合物，被廣泛利用于食品添加(fao/who?expert?committee?on?food?additives,jecfa?no.959)。一方面，它具有良好的藥用價(jià)值，在諸如抗癌、抗炎以及神經(jīng)保護(hù)活性。另一方面，它的安全性極佳，高劑量(按1000mg/kg/day的劑量對(duì)大鼠連續(xù)給藥2周未見(jiàn)明顯不良反應(yīng))，并且其在人體血液中代謝速度快，不會(huì)長(zhǎng)時(shí)間積累導(dǎo)致受藥者生理活動(dòng)受到影響，是一類(lèi)極佳的誘導(dǎo)小分子。
2、來(lái)源于新月柄桿菌的香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子(vanr)，其功能是當(dāng)環(huán)境中不存在va時(shí)，vanr能夠與特異性地結(jié)合一個(gè)或者數(shù)個(gè)反向重復(fù)操縱子vano(attggatccaat)，當(dāng)vanr與va小分子結(jié)合后隨即解離vano。
3、基于va、vanr和vano設(shè)計(jì)的細(xì)胞治療開(kāi)關(guān)香草酸基因電路控制系統(tǒng)van-off系統(tǒng)，該系統(tǒng)在不添加va時(shí)系統(tǒng)會(huì)處于打開(kāi)狀態(tài)，只有通過(guò)持續(xù)性添加va才能保持系統(tǒng)處于關(guān)閉，這樣的邏輯使得該系統(tǒng)在實(shí)際的治療中難以被應(yīng)用?；诖?，開(kāi)發(fā)一種反向調(diào)控香草酸基因電路控制系統(tǒng)的方法或反向調(diào)控的香草酸基因電路控制系統(tǒng)十分重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本申請(qǐng)旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題至少之一。為此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N反向調(diào)控香草酸基因電路控制系統(tǒng)的方法。
2、本申請(qǐng)是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
3、本申請(qǐng)通過(guò)易錯(cuò)pcr誘變的方法，將vanr基因進(jìn)行多輪隨機(jī)突變，并通過(guò)半理性輔助優(yōu)化突變位點(diǎn)，篩選到可以與香草酸結(jié)合后調(diào)控基因邏輯與vanr相反的突變型rvanr(即反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子)。突變型rvanr在不與va小分子結(jié)合時(shí)解離vano(香草酸操縱位點(diǎn))，突變型rvanr結(jié)合va后與操作位點(diǎn)結(jié)合vano。
4、由此，發(fā)明人通過(guò)合成生物學(xué)設(shè)計(jì)了受va調(diào)控的轉(zhuǎn)基因表達(dá)開(kāi)關(guān)裝置，即香草酸基因電路控制系統(tǒng)。含有香草酸基因電路控制系統(tǒng)的工程細(xì)胞，在沒(méi)有va激活的情況下處于靜默狀態(tài)，當(dāng)添加一定濃度(0.1～0.5mm)的va后，可以激活開(kāi)關(guān)表達(dá)下游基因。本申請(qǐng)中的反向調(diào)控的香草酸基因電路控制系統(tǒng)的方法和香草酸基因電路控制系統(tǒng)，在不與va小分子結(jié)合時(shí)解離vano(香草酸操縱子)、結(jié)合va后與香草酸操縱子vano結(jié)合。因此，基于本申請(qǐng)的反向調(diào)控的香草酸基因電路控制系統(tǒng)的方法和反向調(diào)控的香草酸基因電路控制系統(tǒng)在不添加va可保持系統(tǒng)關(guān)閉狀態(tài)，添加va可保持系統(tǒng)激活狀態(tài)，具有更高的實(shí)用性和安全性，為臨床細(xì)胞治療方案提供了新方法與新策略，有良好的臨床應(yīng)用前景。
5、基于此，在本申請(qǐng)的第一方面，本申請(qǐng)?zhí)岢隽艘环N反向調(diào)控香草酸基因電路控制系統(tǒng)的方法。所述香草酸基因電路控制系統(tǒng)包括反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子、香草酸操縱子、和任選的va。所述方法包括：對(duì)香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行氨基酸突變，得到所述反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子；通過(guò)所述反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)對(duì)所述香草酸基因電路控制系統(tǒng)的反向調(diào)控；其中，所述氨基酸突變的位點(diǎn)包括第97位、第127位、第137位、第183位。
6、本申請(qǐng)通過(guò)對(duì)香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子的上述位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸突變，可使發(fā)明的反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子在不添加va時(shí)解離香草酸操縱子；添加va可結(jié)合香草酸操縱子vano。由此，本申請(qǐng)的方法可設(shè)計(jì)反向調(diào)控香草酸基因電路控制系統(tǒng)，使該系統(tǒng)在不添加va可保持系統(tǒng)關(guān)閉狀態(tài)，添加va可保持系統(tǒng)激活狀態(tài)，具有更高的實(shí)用性和安全性，其為臨床細(xì)胞治療方案提供了新方法與新策略，有良好的臨床應(yīng)用前景。
7、在本申請(qǐng)的第二方面，本申請(qǐng)?zhí)岢隽艘环N香草酸基因電路控制系統(tǒng)。根據(jù)本申請(qǐng)的實(shí)施例，所述香草酸基因電路控制系統(tǒng)包括：目標(biāo)蛋白單元，所述目標(biāo)蛋白單元包括香草酸操縱子、誘導(dǎo)表達(dá)核酸序列和目標(biāo)蛋白，所述香草酸操縱子的3’端與誘導(dǎo)表達(dá)核酸序列的5’端相連，所述誘導(dǎo)表達(dá)核酸序列的3’端與編碼所述目標(biāo)蛋白的核酸分子的5’端相連；受體蛋白單元，所述受體蛋白單元包括反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄激活蛋白，所述反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子用于結(jié)合香草酸，所述轉(zhuǎn)錄激活蛋白用于誘導(dǎo)表達(dá)核酸序列；其中，當(dāng)所述香草酸存在時(shí)、所述反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合香草酸操縱子；當(dāng)所述香草酸不存在時(shí)，所述反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子不結(jié)合香草酸操縱子；與香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子相比，所述反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子存在氨基酸突變，所述氨基酸突變的位點(diǎn)包括第97位、第127位、第137位、第183位。
8、本申請(qǐng)的反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子在不添加va時(shí)解離香草酸操縱子；添加va可結(jié)合香草酸操縱子vano。由此，采用上述反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子制備的香草酸基因電路控制系統(tǒng)在不添加va可保持系統(tǒng)關(guān)閉狀態(tài)，添加va可保持系統(tǒng)激活狀態(tài)，具有更高的實(shí)用性和安全性，其為臨床細(xì)胞治療方案提供了新方法與新策略，有良好的臨床應(yīng)用前景。
9、在本申請(qǐng)的第三方面，本申請(qǐng)?zhí)岢隽艘环N基因工程細(xì)胞。根據(jù)本申請(qǐng)的實(shí)施例，所述基因工程細(xì)胞包括第二方面所述的香草酸基因電路控制系統(tǒng)。
10、在本申請(qǐng)的第四方面，本申請(qǐng)?zhí)岢隽说诙矫嫠龅南悴菟峄螂娐房刂葡到y(tǒng)在制備藥物中的用途，所述香草酸基因電路控制系統(tǒng)中的目標(biāo)蛋白選自藥物蛋白。
11、本申請(qǐng)的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本申請(qǐng)的實(shí)踐了解到。
1.一種反向調(diào)控香草酸基因電路控制系統(tǒng)的方法，所述香草酸基因電路控制系統(tǒng)包括反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子、香草酸操縱子、和任選的va，其特征在于，所述方法包括：
2.一種香草酸基因電路控制系統(tǒng)，其特征在于，包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法或權(quán)利要求2的香草酸基因電路控制系統(tǒng)，其特征在于，所述氨基酸突變的位點(diǎn)進(jìn)一步包括第31位和第165位；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法或香草酸基因電路控制系統(tǒng)，其特征在于，所述氨基酸突變的位點(diǎn)選自：
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法和香草酸基因電路控制系統(tǒng)，其特征在于，所述氨基酸突變的位點(diǎn)為第137位，第137位的突變氨基酸為a137v/e/t/d/m/s/a，優(yōu)選為a137v；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法或權(quán)利要求2的香草酸基因電路控制系統(tǒng)，其特征在于，所述香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸突變位點(diǎn)是以seq?id?no:1所示的氨基酸序列進(jìn)行參考定位的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法或權(quán)利要求2的香草酸基因電路控制系統(tǒng)，其特征在于，所述反向香草酸反式轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如seq?id?no:3～seq?id?no:6、seq?id?no:21～seq?id?no:22任一項(xiàng)所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香草酸基因電路控制系統(tǒng)，其特征在于，所述香草酸操縱子的核苷酸序列如seq?id?no:7所示；
9.一種基因工程細(xì)胞，其特征在于，包括權(quán)利要求7～8任一項(xiàng)所述的香草酸基因電路控制系統(tǒng)。
10.權(quán)利要求7～8任一項(xiàng)所述的香草酸基因電路控制系統(tǒng)在制備藥物中的用途，所述香草酸基因電路控制系統(tǒng)中的目標(biāo)蛋白選自藥物蛋白。