本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及化妝品原料中一種重要活性小肽六肽-8(氨基酸序列為eemqrr，谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸)的生物合成方法，新方法相比化學(xué)合成方法具有更低的生產(chǎn)成本，且環(huán)境友好。
背景技術(shù)：
1、乙酰基六肽-8是一種合成肽，常用于抗衰老護(hù)膚品中。它通過抑制神經(jīng)遞質(zhì)的過度釋放，減少肌肉收縮，從而淡化動態(tài)皺紋，如魚尾紋和抬頭紋。其作用類似于肉毒桿菌，但更為溫和且無創(chuàng)。此外，它還能促進(jìn)膠原蛋白生成，提升皮膚彈性，使肌膚更光滑緊致。因其高效且低刺激性，乙?；?8在高端護(hù)膚品中應(yīng)用廣泛。目前乙?；?8通過化學(xué)合成法制備，價格高昂，成本下降空間遇到瓶頸，且生產(chǎn)過程產(chǎn)率低、提純困難，對環(huán)境不夠友好。近年來，合成生物學(xué)快速發(fā)展，許多原本采用化學(xué)合成的產(chǎn)品，變革為生物法合成。采用基因工程手段，通過微生物發(fā)酵合成六肽-8，有望大幅降低其生產(chǎn)成本。針對乙酰基六肽-8的主鏈六肽的生物合成，本發(fā)明巧妙設(shè)計了六肽-8重復(fù)序列的間隔序列，從而打通了六肽-8的生物合成途徑。本發(fā)明可以大幅降低六肽-8的生產(chǎn)成本，對于促進(jìn)乙?；?8的應(yīng)用具有很大的意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于，通過基因工程菌株生物法合成短肽六肽-8。通過設(shè)計六肽-8人工重復(fù)序列打通六肽-8的生物合成途徑。六肽-8重復(fù)序列設(shè)計的關(guān)鍵是，創(chuàng)造性地在重復(fù)序列中插入特定的間隔序列，從而通過定向酶解實現(xiàn)六肽-8的高效合成。
2、所述六肽-8的生物合成方法發(fā)明過程如下：
3、(1)設(shè)計含有六肽-8重復(fù)序列的人工氨基酸序列，命名為六肽-8多重序列，其特點是存在多個重復(fù)的eemqrr序列，且在每個重復(fù)單元之間加入了特定間隔序列kxf或dxf(氨基酸縮寫對應(yīng)關(guān)系為：d，天冬氨酸；k，賴氨酸；x，不限氨基酸種類及其數(shù)量)；
4、(2)委托基因合成公司合成所設(shè)計的六肽-8多重序列的dna序列，并將其整合到微生物表達(dá)質(zhì)粒上，優(yōu)先選擇大腸桿菌pet系列作為表達(dá)質(zhì)粒；
5、(3)將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入工程菌株，發(fā)酵表達(dá)六肽-8多重序列的多肽分子，優(yōu)選選擇大腸桿菌作為工程菌株；
6、(4)收集六肽-8多重序列表達(dá)的的多肽分子，加入糜蛋白酶、lysn酶或aspn酶進(jìn)行水解，通過超濾獲得六肽-8短肽；
7、(5)通過液相色譜質(zhì)譜分析確認(rèn)六肽-8產(chǎn)物的合成。
8、本發(fā)明的有益效果是：
9、所發(fā)明的六肽-8生物合成方法，相比化學(xué)法，不需要高純度的氨基酸以及催化劑等化學(xué)品作為合成原料，所用發(fā)酵培養(yǎng)基價格低廉，發(fā)酵制備工藝簡單，生產(chǎn)過程綠色環(huán)保，有望將來大幅降低生產(chǎn)成本，從而促進(jìn)六肽-8在化妝品行業(yè)的推廣應(yīng)用。
1.一種通過人工序列的重組表達(dá)和定向酶解實現(xiàn)六肽-8(氨基酸序列為谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸，縮寫為eemqrr)高效生物合成的新方法，其特征在于：人工設(shè)計的六肽-8多重序列(dxfeemqrr)n或者(kxfeemqrr)n，在每個eemqrr重復(fù)單元之間加入了特定的氨基酸間隔序列dxf或kxf(d，天冬氨酸；k，賴氨酸；x，不限氨基酸種類及其數(shù)量)，通過微生物重組表達(dá)該序列的多肽產(chǎn)物，然后通過蛋白酶的定向酶解，實現(xiàn)六肽-8的高效生物合成。
2.一種包含權(quán)利要求1所述人工序列編碼基因的重組載體和菌株(優(yōu)選pet質(zhì)粒和大腸桿菌菌株)。
3.權(quán)利要求1所述的蛋白酶定向酶解方法，其特征在于，所用蛋白酶為糜蛋白酶、lysn酶或aspn酶。
4.一種制備乙?；?8的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-3所述方法合成的六肽-8產(chǎn)物，通過n端乙?；揎椷M(jìn)一步制備合成乙酰基六肽-8。