本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法。
背景技術(shù)：
1、短串聯(lián)重復(fù)序列(short?tandem?repeats，str)通常是基因組中由1~6個(gè)堿基單元組成的一段dna重復(fù)序列，由于核心序列重復(fù)數(shù)目在個(gè)體間呈高度變異性并且在基因組中數(shù)量豐富，使str基因座具有良好的遺傳多態(tài)性，是目前繼限制性片段長度多態(tài)性之后的第二代遺傳標(biāo)記，也是應(yīng)用普遍的一類遺傳標(biāo)記。str與以往限制性片段長度多態(tài)性等技術(shù)相比，str因其基因座片段小、擴(kuò)增條件相近能復(fù)合擴(kuò)增的特點(diǎn)，在快速、高效的檢測(cè)微量和降解檢材上表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。
2、目前，在常見案件中案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)情況往往比較復(fù)雜，采集的樣本常受到土壤微生物分解、高溫環(huán)境、化學(xué)品腐蝕等不利因素的影響，導(dǎo)致樣本dna發(fā)生降解或者采集的到dna含量極低。法醫(yī)所獲得的檢材往往是微量或者超微量，然而法醫(yī)在進(jìn)行dna檢測(cè)時(shí)，對(duì)dna的使用量有一定要求，并且針對(duì)一些特殊案情，法醫(yī)需要聯(lián)合使用不同的str試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，例如，dna檢測(cè)是性侵犯調(diào)查和起訴的既定部分。dna證據(jù)的主要目的是識(shí)別嫌疑人或證明性接觸。然而，由于典型斑點(diǎn)中女性和男性dna的比例極不均衡，常規(guī)常染色體分析往往無法檢測(cè)到性侵者的dna。在典型的性侵案件的痕跡中，額外使用y-str分析可以為已報(bào)告的常染色體str分析結(jié)果增加21%的高信息量，相比常染色體str分析，y-str分析更容易檢測(cè)到多個(gè)男性貢獻(xiàn)者，并且y-str分析在無法通過常染色體分析解讀的復(fù)雜混合物中尤為有價(jià)值。
3、常規(guī)str試劑盒擴(kuò)增后的體系中包含模板dna、擴(kuò)增產(chǎn)物、殘留的引物和dntp，若是能去除擴(kuò)增體系中的擴(kuò)增產(chǎn)物、殘留的引物和dntp，經(jīng)純化回收模板dna，原理上回收的dna可用于新的str試劑盒檢測(cè)。但是，目前市面上的str試劑盒使用的是由胸腺嘧啶堿基dttp構(gòu)建的擴(kuò)增體系，含胸腺嘧啶堿基dttp構(gòu)建的擴(kuò)增體系的擴(kuò)增產(chǎn)物不能被特異性的消除，無法在體系中靶向回收原始模板。因此，在有限樣本的情況下做不到使用多試劑盒聯(lián)合檢測(cè)。
4、公開號(hào)為cn107828758a的中國專利，公開了重組尿嘧啶-dna糖苷酶及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用。公開號(hào)為cn106701716b的中國專利，公開了一種熱不穩(wěn)定的ung酶及其應(yīng)用。二者將ung酶添加在pcr反應(yīng)體系中，都是僅用于防止產(chǎn)物污染，并未將ung酶應(yīng)用于產(chǎn)物中原始模板的回收。
5、因此，一種ung酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物、從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法亟待提出。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供一種從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，使用含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物能被ung酶消化而不影響原始模板，通過純化回收原始模板，從而再次用于str試劑盒檢測(cè)，通過多試劑盒聯(lián)合使用能提供更多的分型信息。
2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
3、本發(fā)明提供一種從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，包括以下步驟：
4、s1、將檢測(cè)樣本作為原始模板，使用含dutp的str試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含dutp的擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳檢測(cè)，獲得第一個(gè)分型信息；
5、s2、在檢測(cè)剩余的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入ung酶，進(jìn)行消化處理；
6、s3、將消化后的產(chǎn)物經(jīng)高溫滅活，使用純化試劑盒進(jìn)行純化回收，去掉多余的引物、dntp和消化片段，保留原始模板dna。
7、優(yōu)選的，所述步驟s2中ung酶量為0.1-1u。
8、優(yōu)選的，所述步驟s2中消化處理于pcr儀上進(jìn)行，在50℃下孵育1-3h。
9、優(yōu)選的，所述步驟s3中高溫滅活溫度為95℃，高溫滅活時(shí)間為5-10min。
10、優(yōu)選的，所述步驟s3中純化步驟如下：
11、s31、取消化后的產(chǎn)物放入離心管中，加入裂解液和蛋白酶k；
12、s32、放入金屬浴中；
13、s33、繼續(xù)向離心管中加入磁珠和結(jié)合液，振蕩混勻，放到磁力架上，吸棄廢液；
14、s34、加入漂洗液i，振蕩混勻放入磁力架上，吸棄廢液；
15、s35、加入漂洗液ii，振蕩混勻放入磁力架上，吸棄廢液；
16、s36、打開離心管蓋子晾干磁珠；
17、s37、加入洗脫液，放入金屬浴中。
18、優(yōu)選的，所述步驟s31中裂解液的份量為400-600μl，蛋白酶k的份量為10-20μl，所述步驟s33中磁珠的份量為20-30μl，結(jié)合液的份量為200-300μl，所述步驟s37中洗脫液的份量為20-50μl。
19、優(yōu)選的，所述步驟s32中金屬浴的溫度為56℃，時(shí)間為30min；所述步驟s37中金屬浴的溫度為60℃，時(shí)間為10min。
20、優(yōu)選的，所述步驟s34中漂洗液含有50%的聚乙二醇，所述步驟s35中漂洗液ii含80%的乙醇和3?m的氯化鈉。
21、本發(fā)明相較于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下有益效果：
22、本發(fā)明由于在新合成的擴(kuò)增子中含有dutp，ung酶可有效催化水解單鏈或雙鏈dna中的dutp和糖磷酸骨架的n-糖苷鍵，使得缺失堿基的dna鏈在堿性介質(zhì)和高溫下進(jìn)一步水解和斷裂，同時(shí)保持天然的含胸腺嘧啶堿基的dna完好無損。因此，在法醫(yī)str分型檢測(cè)中，當(dāng)樣本核酸僅夠做一次檢測(cè)且無法重復(fù)采樣時(shí)，dttp用dutp代替，第一輪pcr結(jié)束獲得分型信息后，產(chǎn)物使用ung酶在一定溫度條件下孵育一定時(shí)間，可降解任何含dutp的pcr產(chǎn)物，消除殘留污染，保留原始dna模板。隨后將反應(yīng)管在高溫孵育可有效滅活ung酶，后續(xù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，回收的模板dna用于其他str試劑盒分型檢測(cè)，獲得更多的分型信息。
1.一種從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，其特征在于，所述步驟s2中ung酶量為0.1-1u。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，其特征在于，所述步驟s2中消化處理于pcr儀上進(jìn)行，在50℃下孵育1-3h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，其特征在于，所述步驟s3中高溫滅活溫度為95℃，高溫滅活時(shí)間為5-10min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，其特征在于，所述步驟s3中純化步驟如下：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，其特征在于，所述步驟s31中裂解液的份量為400-600μl，蛋白酶k的份量為10-20μl，所述步驟s33中磁珠的份量為20-30μl，結(jié)合液的份量為200-300μl，所述步驟s37中洗脫液的份量為20-50μl。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，其特征在于，所述步驟s32中金屬浴的溫度為56℃，時(shí)間為30min；所述步驟s37中金屬浴的溫度為60℃，時(shí)間為10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從含dutp的str試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物中回收原始模板dna的方法，其特征在于，所述步驟s34中漂洗液i含有50%的聚乙二醇，所述步驟s35中漂洗液ii含80%的乙醇和3?m的氯化鈉。