本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體涉及一種火龍果vigs體系的指示基因 hpbhlh48及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus-induced?gene?silencing，vigs）是研究植物基因功能的一種方法，具有周期短、操作簡便、成本低等優(yōu)勢。vigs技術(shù)的病毒侵染具有局部性和時(shí)效性。因此，很有必要用一個(gè)指示基因來標(biāo)記沉默的區(qū)域以及沉默發(fā)生的時(shí)間。八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoene?desaturase， pds）是較為常用的指示基因，其是類胡蘿卜素合成通路上一個(gè)關(guān)鍵基因，具有保護(hù)葉綠素免受光漂白的作用。當(dāng) pds基因被沉默后，其mrna水平顯著降低，導(dǎo)致類胡蘿卜素合成途徑被阻斷，從而使被侵染植物新生葉片表現(xiàn)出白化效應(yīng)，可以用肉眼直接觀察。因此 pds基因應(yīng)用于棉花、水稻、芒草和絲瓜等多種植物的vigs體系中。然而，隨著火龍果果實(shí)的發(fā)育，甜菜紅素會(huì)隨果實(shí)的膨大在果皮和果肉中逐漸積累，形成的紅紫色會(huì)遮蓋 pds沉默產(chǎn)生的白化現(xiàn)象，使 pds基因無法在火龍果果實(shí)發(fā)育期作為vigs體系的指示基因。因此，需要開發(fā)出一種新的火龍果vigs體系的指示基因。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種火龍果vigs體系的指示基因 hpbhlh48及應(yīng)用，以提供一種新的火龍果vigs體系的指示基因。
2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：提供一種火龍果vigs體系的指示基因 hpbhlh48，指示基因 hpbhlh48的編碼區(qū)核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
3、本發(fā)明提供了一種上述的指示基因 hpbhlh48在制備trv2-hpbhlh48重組載體中的應(yīng)用。
4、本發(fā)明提供了一種trv2-hpbhlh48重組載體，包含trv2載體和上述的指示基因 hpbhlh48。
5、本發(fā)明提供了一種上述的trv2-hpbhlh48重組載體的制備方法，包括以下步驟：
6、（1）擴(kuò)增 hpbhlh48基因cds的3’端非保守片段：分別以hpbhlh48-f和hpbhlh48-r為引物，以 hpbhlh48的編碼區(qū)核苷酸序列為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，回收純化pcr產(chǎn)物；
7、（2）選取 bamhi和 saci限制性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以步驟（1）所得產(chǎn)物為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，回收純化pcr產(chǎn)物，制得含有 bamhi和 saci這兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的片段；
8、（3）采用 bamhi和 saci酶切trv2載體，回收酶切產(chǎn)物，制得trv2酶切片段；然后將trv2酶切片段與步驟（2）所得目的片段進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，制得。
9、進(jìn)一步，步驟（1）中 hpbhlh48基因cds的3’端非保守片段的核苷酸序列如seq?idno.2所示。
10、進(jìn)一步，步驟（1）中hpbhlh48-f和hpbhlh48-r的核苷酸序列分別seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。
11、進(jìn)一步，步驟（2）中引物為bamh?i-f和sac?i-r，其核苷酸序列分別如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示。
12、進(jìn)一步，步驟（3）中酶切體系為：10μl?trv2、1μl?bamh?i、1μl?sac?i、1μl?5×kbuffer，7μl雙蒸水；連接體系為：3μl目的片段、2μl?trv2雙酶切片段、5μl?2×seamlesscloning?master?mix。
13、本發(fā)明還提供了一種上述的trv2-hpbhlh48重組載體在火龍果vigs注射中應(yīng)用，注射trv2-hpbhlh48重組載體后若火龍果果皮保持綠色，則指示 hpbhlh48基因已沉默。
14、本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明發(fā)現(xiàn) hpbhlh48基因是火龍果甜菜色素合成的一個(gè)相關(guān)基因，可以調(diào)控甜菜色素合成關(guān)鍵基因啟動(dòng)子的表達(dá)，從而參與甜菜色素的合成。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，trv1-trv2空載體（trv：tobacco?rattle?virus，煙草脆裂病毒）注射火龍果果皮后，注射trv1-trv2空載體的區(qū)域僅出現(xiàn)結(jié)痂，正常轉(zhuǎn)色為紅色；而注射trv2-hpbhlh48重組載體（ptrv2-hpbhlh48）后，注射區(qū)域的火龍果果皮顏色保持綠色，未發(fā)生轉(zhuǎn)色。由此說明，甜菜色素合成調(diào)控基因 hpbhlh48已被沉默， hpbhlh48基因無法表達(dá)導(dǎo)致火龍果果皮的甜菜色素?zé)o法合成，從而火龍果果皮表型為綠色。由圖3可知，注射trv2-hpbhlh48重組載體（ptrv2-hpbhlh48）的火龍果果皮區(qū)域的 hpbhlh48基因的表達(dá)水平顯著低于注射trv1-trv2空載體（ptrv2）的火龍果果皮區(qū)域，說明指示基因 hpbhlh48被有效沉默。以上結(jié)果表明， hpbhlh48可作為火龍果vigs體系的指示基因。本發(fā)明也為今后火龍果果實(shí)發(fā)育基因的功能驗(yàn)證提供了技術(shù)儲(chǔ)備。
1.一種火龍果vigs體系的指示基因hpbhlh48，其特征在于，所述指示基因hpbhlh48的編碼區(qū)核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的指示基因hpbhlh48在制備trv2-hpbhlh48重組載體中的應(yīng)用。
3.一種trv2-hpbhlh48重組載體，其特征在于，包含trv2載體和權(quán)利要求1所述的指示基因hpbhlh48。
4.權(quán)利要求3所述的trv2-hpbhlh48重組載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）中所述hpbhlh48的3’端非保守片段的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）中所述hpbhlh48-f和hpbhlh48-r的核苷酸序列分別seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中所述引物為bamhi-f和saci-r，其核苷酸序列分別如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中所述酶切體系為：10μltrv2、1μl?bamh?i、1μl?sac?i、1μl?5×k?buffer，7μl雙蒸水；所述連接體系為：3μl目的片段、2μl?trv2酶切片段、5μl?2×seamless?cloning?master?mix。
9.權(quán)利要求3所述的trv2-hpbhlh48重組載體在火龍果vigs注射中應(yīng)用，其特征在于，注射trv2-hpbhlh48重組載體后若火龍果果皮為綠色，則指示hpbhlh48基因已沉默。