本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)，尤其涉及一種用于檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的引物探針組合、試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、長(zhǎng)江鱘(acipenserdabryanus)是我國(guó)長(zhǎng)江上游特有魚類，又名鱘魚、沙臘子，為淡水定居性魚類，棲息于長(zhǎng)江上游水流較急、石質(zhì)河底的水流中。長(zhǎng)江鱘體型較小、體重較輕，是長(zhǎng)江生態(tài)健康的重要指示生物。為了保護(hù)野外長(zhǎng)江鱘種群數(shù)量，自2018年開始，地方政府、相關(guān)研究機(jī)構(gòu)每年都會(huì)進(jìn)行長(zhǎng)江鱘野外增殖放流活動(dòng)，但截至目前，長(zhǎng)江全江段均未發(fā)現(xiàn)自然繁殖的長(zhǎng)江鱘幼苗。放流長(zhǎng)江鱘能否在長(zhǎng)江建立穩(wěn)定種群、進(jìn)行自然繁殖是野外長(zhǎng)江鱘種群數(shù)量恢復(fù)的關(guān)鍵。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)魚類群體的動(dòng)態(tài)，如洄游、分布等，對(duì)漁業(yè)資源評(píng)估、魚類資源保護(hù)、維護(hù)水域生態(tài)平衡具有重要意義。傳統(tǒng)的魚類檢測(cè)方法為通過(guò)下網(wǎng)捕撈魚體來(lái)調(diào)查魚類的分布范圍，這類方法雖然直觀有效，但是對(duì)魚類群體存在一定的損傷，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
2、目前對(duì)長(zhǎng)江鱘放流標(biāo)記追蹤技術(shù)主要有以下幾種：pit標(biāo)記、聲吶標(biāo)記、t型標(biāo)記。其中通過(guò)聲吶標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)江鱘在長(zhǎng)江活動(dòng)過(guò)程的記錄；但是其需要在沿江設(shè)置多個(gè)聲吶信號(hào)接收器，成本較高；而pit標(biāo)記、t型標(biāo)記以及dna標(biāo)記需要在魚體中打上標(biāo)記，由于標(biāo)記魚體占放流魚體的比例較小，通過(guò)追蹤標(biāo)記魚體來(lái)推斷整個(gè)魚群的行為軌跡時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)漏測(cè)的情況，收集到的可用數(shù)據(jù)甚少，不利于充分了解放流魚體的行為、分布偏好等。此外，標(biāo)記法也會(huì)傷害魚體，聲吶裝置也會(huì)對(duì)水生生物的接受和發(fā)送信息進(jìn)行干擾，造成水生生物的活動(dòng)出現(xiàn)異常，嚴(yán)重時(shí)造成死亡。因此有必要開發(fā)一種不傷害魚體、不影響其他水生生物正常生命活動(dòng)的追蹤方法來(lái)揭示放流長(zhǎng)江鱘的行為軌跡。
3、edna是指從環(huán)境樣本中直接獲取的dna，包括動(dòng)植物、微生物在空氣、土壤、水體等環(huán)境中釋放的dna。edna技術(shù)是指從環(huán)境樣品中直接提取目的基因片段后利用各種分子技術(shù)進(jìn)行定性或定量分析的方法。利用環(huán)境dna技術(shù)可以有效檢測(cè)到水體中的稀有物種和隱秘物種，提高調(diào)查結(jié)果的準(zhǔn)確性。edna技術(shù)于2008年首次用于追蹤美國(guó)牛蛙的分布，此后被廣泛用于檢測(cè)兩棲動(dòng)物和魚類。與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，edna方法具有省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以更全面地調(diào)查物種多樣性，也能更靈敏更具特異性地檢測(cè)單一物種，例如外來(lái)種或入侵物種的擴(kuò)散、瀕危物種的大規(guī)模監(jiān)測(cè)等。已有研究表明，根據(jù)長(zhǎng)江鱘基因序列設(shè)計(jì)的引物可較好地區(qū)分長(zhǎng)江鱘和長(zhǎng)江中的常見魚類，但仍會(huì)檢測(cè)到一些親緣關(guān)系較近的鱘，無(wú)法特異性地鑒別長(zhǎng)江鱘和其他鱘類，尤其是無(wú)法將長(zhǎng)江鱘和中華鱘有效地區(qū)分。因此，開發(fā)一種能特異性檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的引物尤為必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的引物探針組合、試劑盒及其應(yīng)用，利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)和taqman熒光探針，對(duì)待測(cè)水樣中的edna進(jìn)行擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)江鱘的特異性檢測(cè)。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
3、本發(fā)明提供了一種檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的引物探針組合，所述引物探針組合包括上游引物、下游引物和探針；所述上游引物的核苷酸序列如seq?idno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
4、本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的引物探針組合，所述引物探針組合包括上游引物、下游引物和探針；所述上游引物的核苷酸序列如seq?idno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
5、優(yōu)選的，所述探針的3’端用6-fam修飾，5’端用bhq1修飾。
6、本發(fā)明還提供了所述的引物探針組合在制備檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的試劑盒中的應(yīng)用。
7、本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的試劑盒，包括所述的引物探針組合。
8、本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的方法，包括以下步驟：
9、s1.從待測(cè)水樣中提取edna，將所述edna與所述的引物探針組合混合，進(jìn)行ddpcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
10、s2.將s1得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行微滴讀取，若得到陽(yáng)性微滴，則待測(cè)水樣中含有長(zhǎng)江鱘edna。
11、優(yōu)選的，所述ddpcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×ddpcr探針?lè)╩ix?10μl、上游引物1.8μl、下游引物1.8μl、探針0.5μl、ddh2o?3.9μl和edna2μl。
12、優(yōu)選的，所述上游引物、下游引物和探針的初始濃度分別為10μm。
13、優(yōu)選的，所述ddpcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?6℃10min；94℃30s，55℃1min，40個(gè)循環(huán)；98℃10min。
14、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果：
15、1、本發(fā)明通過(guò)對(duì)長(zhǎng)江鱘及長(zhǎng)江流域常見魚類線粒體dna序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)篩選到了能特異性的檢測(cè)長(zhǎng)江鱘目的dna片段的特異性引物對(duì)和taqman熒光探針，利用該特異性引物對(duì)和taqman熒光探針可以特異性的、穩(wěn)定有效的擴(kuò)增出長(zhǎng)江鱘的目的dna片段。
16、2、本發(fā)明篩選得到的特異性引物對(duì)和taqman熒光探針，可以成功檢測(cè)到養(yǎng)殖水體和野外水體中長(zhǎng)江鱘目的dna片段，靈敏度為0.07copies/μl，具有較高的靈敏性。
17、3、本發(fā)提供了一種基于探針?lè)▽?duì)長(zhǎng)江鱘的行為軌跡進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法，主要是基于篩選得到的特異性引物對(duì)和taqman熒光探針進(jìn)行水體環(huán)境dna濃度的檢測(cè)，從而確定該水域有無(wú)長(zhǎng)江鱘分布，相對(duì)于傳統(tǒng)的捕撈法及常用的聲吶監(jiān)測(cè)法，不需要大量昂貴的設(shè)備，對(duì)魚體不會(huì)產(chǎn)生傷害且省時(shí)省力，可以用于長(zhǎng)江鱘的edna檢測(cè)。
1.一種檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包括上游引物、下游引物和探針；所述上游引物的核苷酸序列如seq?idno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
2.一種檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包括上游引物、下游引物和探針；所述上游引物的核苷酸序列如seq?idno.4所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，所述探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物探針組合，其特征在于，所述探針的3’端用6-fam修飾，5’端用bhq1修飾。
4.權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的引物探針組合在制備檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的引物探針組合。
6.權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的引物探針組合或權(quán)利要求5所述的試劑盒在檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna中的應(yīng)用。
7.一種檢測(cè)長(zhǎng)江鱘edna的方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述ddpcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×ddpcr探針?lè)╩ix?10μl、上游引物1.8μl、下游引物1.8μl、探針0.5μl、ddh2o?3.9μl和edna2μl。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探針的初始濃度分別為10μm。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述ddpcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?6℃10min；94℃30s，55℃1min，40個(gè)循環(huán)；98℃10min。