本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)和微生物，尤其涉及一種接種防病促生菌提高作物抗病能力的育苗方法。

背景技術(shù)：

1、植物病毒病一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的棘手難題，對作物的產(chǎn)量與品質(zhì)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。番茄、辣椒和生姜等作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，飽受多種病毒侵害。

2、番茄褐色皺果病毒(tomato?brown?rugose?fruit?virus，tobrfv)?是一種嚴(yán)重危害番茄、辣椒等茄科蔬菜作物的新型病毒，其傳播途徑多，經(jīng)濟(jì)危害性強(qiáng)。近幾年，該病毒在我國山東、江蘇和云南等主產(chǎn)區(qū)已經(jīng)全面暴發(fā)，嚴(yán)重影響了國內(nèi)番茄、辣椒生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，損失極其嚴(yán)重。該病毒產(chǎn)生與研究周期短，截止目前我國沒有針對性的抗性品種和綠色防治技術(shù)。因此，創(chuàng)制抗性種苗、建立綠色栽培與綜合防控體系是我國番茄、辣椒等種植業(yè)迫在眉睫的問題。

3、生姜以根狀莖作為繁殖材料，繁殖系數(shù)低、易通過種姜傳播病害而且長期無性繁殖造成種性退化，易感染病毒。近年來，國內(nèi)外生姜的脫毒脫菌組培苗研究已取得較大的進(jìn)步，生姜組培苗可以解決種姜體內(nèi)攜帶病毒和各種病原菌的問題，但難以解決組培苗移栽到自然環(huán)境中對復(fù)雜的土壤條件和病原菌侵染等快速適應(yīng)問題，迫切尋找一種與組培脫毒技術(shù)配套的提高抗病能力的方法。

4、傳統(tǒng)化學(xué)防治方法的局限性促使人們尋求更綠色、有效的防控策略。因此，植物組織培養(yǎng)技術(shù)和微生物誘導(dǎo)抗病毒技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。其中防病促生菌能夠與植物相互作用，直接或間接地幫助植物獲得營養(yǎng)物質(zhì)、分泌促生物質(zhì)調(diào)節(jié)植物生長水平、提高植物抗病原菌能力等，成為綠色防控策略的熱點(diǎn)。目前對防病促生菌的應(yīng)用主要有種子包衣法、根際灌施法、葉面噴施法、土壤(或栽培基質(zhì))直接施用法等，而將組織培養(yǎng)技術(shù)與防病促生菌相結(jié)合等尚未報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種接種防病促生菌提高作物抗病能力的育苗方法，即將組織培養(yǎng)技術(shù)與防病促生菌有機(jī)結(jié)合，在無菌條件下提前將防病促生菌定殖番茄、辣椒及生姜等作物體內(nèi)，進(jìn)而提高番茄、辣椒和生姜植株抗病毒病能力，達(dá)到抗病育苗目的。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

3、提供一種接種防病促生菌提高作物抗病能力的育苗方法，包括如下步驟：

4、步驟一，采用組織培養(yǎng)的方式培養(yǎng)待接防病促生菌的組培苗；

5、步驟二，在所述組培苗的根部接種所述防病促生菌；

6、步驟三，抽檢確定所述防病促生菌在所述組培苗體內(nèi)是否定殖成功，如果定殖成功則進(jìn)入步驟五，如果定殖不成功則先進(jìn)入步驟四再進(jìn)入步驟五；

7、步驟四，步驟二中接種所述防病促生菌時同步加入輔助菌；

8、步驟五，對所述防病促生菌定殖成功的所述組培苗進(jìn)行馴化及移栽。

9、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述防病促生菌為抗番茄褐色皺果病毒病的粘質(zhì)沙雷氏菌或貝萊斯芽孢桿菌；其中，

10、所述粘質(zhì)沙雷氏菌為粘質(zhì)沙雷氏菌wf01，于2024年4月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：cgmcc?no.30368；

11、所述貝萊斯芽孢桿菌為貝萊斯芽孢桿菌wf02，于2024年5月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：cgmcc?no.30756。

12、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，當(dāng)所述防病促生菌為所述貝萊斯芽孢桿菌wf02時，所述輔助菌為耐低溫芽孢桿菌wf04，所述耐低溫芽孢桿菌wf04于2024年5月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：cgmcc?no.30758。

13、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟一中的所述組培苗為番茄組培苗或辣椒組培苗，所述步驟一具體如下：

14、步驟1a，無菌條件下對飽滿、健康、無蟲害的番茄或辣椒種子進(jìn)行消毒處理，然后將番茄或辣椒種子平鋪到種子萌發(fā)固體培養(yǎng)基表面，待種子萌發(fā)后6～8d，子葉完全展開時進(jìn)行步驟1b；

15、步驟1b，切取子葉中段作為外植體，外植體大小為0.5cm×0.5cm，接種到以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加1～1.5mg/l?6-ba、0.5～0.7mg/l?naa、30～50g/l蔗糖和6～8g/l瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)7～8周獲得愈傷組織及不定芽，待所述不定芽長至約2cm時進(jìn)行步驟1c；

16、步驟1c，將步驟1b獲得的所述不定芽接到以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基且附加30～50g/l蔗糖、6～8g/l瓊脂的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待生根后繼續(xù)培養(yǎng)10?d，獲得所述番茄組培苗或所述辣椒組培苗。

17、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟一中的所述組培苗為生姜組培苗，所述生姜組培苗為姜芽莖尖依次經(jīng)過愈傷組織培養(yǎng)、叢芽增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)三個階段獲得的脫毒成功的生姜組培苗。

18、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟二具體如下：

19、將活化后的所述防病促生菌接種到nb液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液的光密度值為0.8～1.0，獲得菌液；在無菌條件下，將所述菌液接種到步驟一中的所述組培苗根部，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行所述步驟三的操作。

20、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟三具體如下：

21、步驟3a，隨機(jī)抽取步驟二中接種了所述防病促生菌的所述組培苗，在無菌條件下剪取所述組培苗的葉片，搗碎，吸取50ul汁液并均勻涂布到na固體培養(yǎng)基上，28℃條件下倒置培養(yǎng)24h；

22、步驟3b，觀察涂有葉片汁液的na固體培養(yǎng)基上是否有單菌落，若有單菌落且同類型的單菌落不少于50個，對選定的單菌落形態(tài)與原始防病促生菌單菌落形態(tài)進(jìn)行比較，若菌落形態(tài)比對結(jié)果相似，則進(jìn)行步驟3c；

23、步驟3c，挑取涂有葉片汁液的na固體培養(yǎng)基中的待測單菌落接種到nb液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)12?h，獲得菌液；

24、步驟3d，取所述菌液，進(jìn)行16s?rdna基因測序，將測序結(jié)果與原始防病促生菌的基因序列進(jìn)行比對，若基因測序結(jié)果一致則判定為定殖成功，基因測序結(jié)果不一致則判定為定殖不成功；定殖成功則進(jìn)行步驟五，定殖不成功則進(jìn)行步驟四。

25、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟四具體如下：

26、將活化后的所述防病促生菌和所述輔助菌接種到nb液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液的光密度值為0.8～1.0，獲得防病促生菌菌液和輔助菌菌液；在無菌條件下，將所述防病促生菌菌液和所述輔助菌菌液按照體積比1:1混合均勻，將混合后的菌液接種到步驟一中的所述組培苗根部，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行所述步驟五。

27、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟五具體如下：

28、步驟5a，所述防病促生菌定殖成功的所述組培苗，在培養(yǎng)箱內(nèi)半開組培瓶蓋馴化1～2d，然后全開組培瓶蓋馴化1～2d，最后在自然環(huán)境下馴化1～2d；

29、步驟5b，將馴化后的所述組培苗從組培瓶中移栽到滅菌的栽培基質(zhì)中，生長28~30d，得到抗病的所述組培苗。

30、本發(fā)明還提供一種接種防病促生菌提高番茄或辣椒抗病能力的育苗方法，其特征在于，包括如下步驟：

31、步驟a：無菌條件下，對飽滿、健康、無蟲害的番茄或辣椒種子進(jìn)行消毒處理，然后將所述番茄種子或所述辣椒種子平鋪到組培瓶中的固體培養(yǎng)基表面，待種子萌發(fā)10d后，獲得種苗；

32、步驟b：將活化后的所述粘質(zhì)沙雷氏菌wf01接種到nb液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液的光密度值為0.8～1.0，獲得菌液；在無菌條件下，將所述菌液接種到步驟a中的所述種苗根部，繼續(xù)培養(yǎng)24h；

33、步驟c：隨機(jī)抽取步驟b中接種了所述粘質(zhì)沙雷氏菌wf01的所述種苗，在無菌條件下剪取所述種苗的葉片，搗碎，吸取50ul汁液并均勻涂布到na固體培養(yǎng)基上，28℃條件下倒置培養(yǎng)24h；觀察涂有葉片汁液的na固體培養(yǎng)基上是否有鮮紅色單菌落，若定殖不成功則無鮮紅色單菌落，若定殖成功則有鮮紅色單菌落且同類型的單菌落不少于50個，對所述粘質(zhì)沙雷氏菌wf01定殖成功的所述種苗進(jìn)行馴化及移栽。

34、由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：將作物組織培養(yǎng)技術(shù)與防病促生菌有機(jī)結(jié)合，在無其他微生物干擾的條件下提前將防病促生菌定殖番茄、辣椒和生姜等作物體內(nèi)，不僅能促進(jìn)組培苗的生長提高防病促生菌體內(nèi)定向接種效率，同時可提高組培苗移栽成活率及提高移栽后作物的抗病能力；粘質(zhì)沙雷氏菌wf01或貝萊斯芽孢桿菌wf02有效提高番茄等作物植株抗tobrfv病能力，達(dá)到抗tobrfv病育苗目的；對于番茄和辣椒來說，不采用組織培養(yǎng)的方式，直接用種子培養(yǎng)種苗，并在種苗根部接種防病促生菌也能成功定殖；粘質(zhì)沙雷氏菌wf01能分泌深紅色的色素，所用的定殖檢測方法簡單可行。