本發(fā)明屬于疫苗佐劑，具體涉及一種殼聚糖基疫苗佐劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
1、佐劑是一類可以加速、延長或增強抗原特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)，與疫苗共同組成疫苗制劑。佐劑本身不具有抗原性，可以增強抗原特異性免疫應(yīng)答，添加到疫苗中可以減少抗原使用量，增強免疫效果，在一定程度上可以決定疫苗的品質(zhì)。
2、殼聚糖是一種天然的可生物降解聚合物，已有研究證明其能夠刺激獲得性免疫反應(yīng)。殼聚糖還被報道可以增強th?l免疫，從而成為家禽活疫苗的一種潛在佐劑。但是，殼聚糖在ph?6.5以上的水溶液中溶解度低，不溶于有機溶劑,加熱不熔化,高溫直接碳化，大大的限制了其應(yīng)用。
3、為了獲得更好的溶解度、親水性和潛在的生物活性，殼聚糖通常通過季銨鹽化、?；?、羧化、硫酸化等方法進行改性。然而，殼聚糖或其衍生物直接用作佐劑時，持續(xù)時間短，疫苗免疫效果受限。因此，有必要提供具有穩(wěn)定緩釋功能的一種殼聚糖基疫苗佐劑及其制備方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種殼聚糖基疫苗佐劑及其制備方法，以解決背景技術(shù)中殼聚糖或其衍生物直接用作佐劑時，持續(xù)時間短，疫苗免疫效果受限的問題。
2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
3、一種殼聚糖基疫苗佐劑，包括以下重量份原料：
4、殼聚糖負電荷衍生物6.25～10份，殼聚糖正電荷衍生物1～4份；
5、其中，殼聚糖正電荷衍生物為殼聚糖季銨化衍生物，合成步驟如下：
6、將殼聚糖和含環(huán)氧基的季銨鹽加入到蒸餾水中，并在70～80℃下進行攪拌，反應(yīng)時間為24h；將得到的反應(yīng)液在透析袋中使用蒸餾水透析72h后，在凍干機中-80℃條件下凍干，即得到殼聚糖季銨化衍生物。
7、進一步地，所述殼聚糖的分子量為30～200kda；殼聚糖和含環(huán)氧基的季銨鹽的質(zhì)量比為1：2。
8、進一步地，所述攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為200～400r/min。
9、進一步地，所述含環(huán)氧基的季銨鹽的制備步驟為：
10、步驟(1)：將溴代十二烷和n-甲基-2-羥基乙胺加入無水乙醇中，100℃下攪拌12h,反應(yīng)完成后，減壓旋蒸除掉乙醇，得到粗產(chǎn)物。所得粗產(chǎn)物用丙酮重結(jié)晶后，依次用氫氧化鈉水溶液和水洗滌，得固體，真空干燥備用。
11、步驟(2)：將步驟(1)制備的固體加入到無水乙醇中，加熱至60℃，攪拌，取環(huán)氧氯丙烷于恒壓滴液漏斗中，30min內(nèi)滴定完全。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去無水乙醇，用乙酸乙酯進行重結(jié)晶，抽濾后于45℃條件下真空干燥12h，即得到含環(huán)氧基的季銨鹽。
12、其中，步驟(1)所述溴代十二烷和n-甲基-2-羥基乙胺的摩爾比為1～1.2：1。
13、其中，步驟(1)所述氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量分數(shù)為5％。
14、其中，步驟(2)所述固體和1,4-二溴丁烷的摩爾比為2～2.1：1；固體、無水乙醇、環(huán)氧氯丙烷和乙酸乙酯的用量比為69.3g：60～80m?l：27.7～33.3g：50～70m?l。
15、其中，步驟(2)所述含環(huán)氧基的季銨鹽的合成步驟如下：
16、
17、進一步地，所述殼聚糖負電荷衍生物為0位取代羧甲基殼聚糖，具體由以下步驟合成：
18、將水和異丙醇混合，形成為混合液a，取的殼聚糖和氫氧化鈉加入混合液a中，在50℃條件下，水浴攪拌堿化反應(yīng)1h，形成反應(yīng)液；
19、在異丙醇溶液中溶解氯乙酸，形成混合液b，將混合液b在30min內(nèi)滴加入反應(yīng)液中，反應(yīng)4h；加入乙醇水溶液終止反應(yīng)；透析，冷凍干燥，即得到0位取代羧甲基殼聚糖。
20、其中，混合溶液a中水和異丙醇的體積比為1:4。
21、其中，殼聚糖的分子量為200kda；殼聚糖和氫氧化鈉的質(zhì)量比為10:13.5。
22、其中，異丙醇和氯乙酸的用量比為4m?l:3g。
23、其中，乙醇水溶液的體積比為70％，用量為200m?l。
24、一種殼聚糖基疫苗佐劑的制備方法，包括以下步驟：
25、將殼聚糖負電荷衍生物和水混合得到溶液a，殼聚糖正電荷衍生物和水混合得到溶液b，溶液a和溶液b在室溫下與混合，磁力拌20～40min后，即得殼聚糖基疫苗佐劑。
26、其中，所述溶液a的濃度為1～2mg/m?l；溶液b的濃度為1～2mg/m?l。
27、其中，所述殼聚糖基疫苗佐劑在4℃保存。
28、本發(fā)明的有益效果：
29、本發(fā)明通過同時引入親水基團和疏水基團，并結(jié)合季銨鹽帶正電荷的性質(zhì)，使殼聚糖基疫苗佐劑包裹在抗原周圍，并形成保護膠束和膜結(jié)構(gòu)，保證了抗原釋放過程中的穩(wěn)定性。具有安全和穩(wěn)定緩釋的特點。
30、本發(fā)明制備的一種殼聚糖基疫苗佐劑具有出色的緩釋性，原因在于本發(fā)明制備的殼聚糖基疫苗佐劑中既含有親水性的羥基基團，也含有疏水性的烷基長鏈。這種親水性和疏水性的平衡使得該殼聚糖基疫苗佐劑能夠在水溶液中形成穩(wěn)定的膠束或膜結(jié)構(gòu)，進而有效地包裹和固定抗原分子，再加上季銨鹽本身的穩(wěn)定性和正電荷性質(zhì)，該殼聚糖基疫苗佐劑能夠保證抗原在釋放過程中的穩(wěn)定，從而達到穩(wěn)定緩釋的效果。
31、本發(fā)明制備的一種殼聚糖基疫苗佐劑具有出色的穩(wěn)定性，原因在于本發(fā)明使用帶正電荷的季銨鹽制備了殼聚糖季銨化衍生物來作為殼聚糖基疫苗佐劑，而正電荷使得季銨鹽能夠與帶負電荷的抗原分子產(chǎn)生靜電吸引，從而增強它們之間的結(jié)合力。而且季銨鹽的化學(xué)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，不易被生物體內(nèi)的酶解或水解作用破壞。因此，殼聚糖季銨化衍生物能夠長時間保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而確?？乖肿拥姆€(wěn)定結(jié)合和釋放。
32、本發(fā)明制備的一種殼聚糖基疫苗佐劑無交聯(lián)劑的毒副作用，原因在于該殼聚糖基疫苗佐劑通過靜電吸附作用合成，沒有任何交聯(lián)劑的使用，免去了由于使用交聯(lián)劑產(chǎn)生的毒副作用。
1.一種殼聚糖基疫苗佐劑，其特征在于，包括以下重量份原料：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖基疫苗佐劑，其特征在于，所述含環(huán)氧基的季銨鹽的制備步驟為：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖基疫苗佐劑，其特征在于，所述殼聚糖的分子量為30～200kda；殼聚糖和含環(huán)氧基的季銨鹽的質(zhì)量比為1：2；攪拌速度為200～400r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種殼聚糖基疫苗佐劑，其特征在于，步驟(1)所述溴代十二烷和n-甲基-2-羥基乙胺的摩爾比為1～1.2：1；氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量分數(shù)為5％。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種殼聚糖基疫苗佐劑，其特征在于，步驟(2)所述固體、無水乙醇、環(huán)氧氯丙烷和乙酸乙酯的用量比為69.3g：60～80m?l：27.7～33.3g：50～70m?l。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖基疫苗佐劑，其特征在于，所述殼聚糖負電荷衍生物為0位取代羧甲基殼聚糖，具體由以下步驟合成：
7.一種如權(quán)利1～6任一項所述殼聚糖基疫苗佐劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種殼聚糖基疫苗佐劑的制備方法，其特征在于，所述溶液a的濃度為1～2mg/m?l；溶液b的濃度為1～2mg/m?l。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種殼聚糖基疫苗佐劑的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖基疫苗佐劑在4℃保存。