本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)美容和化妝品領(lǐng)域，涉及一種mrna分子及其在制備美容護(hù)膚產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、皮膚是人體最大的器官，約占體重的16％。皮膚覆蓋于全身表面，是唯一有保護(hù)、體溫調(diào)節(jié)、分泌和排泄汗液及油脂、吸收、感覺、參與機(jī)體的代謝和免疫外界侵襲的功能的器官，皮膚主要分為三大層，從外到里，分為表皮層、真皮層、皮下組織。

2、皮膚衰老是其受內(nèi)部與外部因素共同影響而使人體機(jī)能或快或慢自然發(fā)展的一個過程，其主要是由內(nèi)源性老化和外源性老化造成。主要表現(xiàn)為細(xì)胞代謝逐漸減緩，膠原蛋白逐漸流失，膠原質(zhì)受到破壞，皮膚厚度轉(zhuǎn)薄，彈性纖維斷裂，從而出現(xiàn)干燥粗糙、皺紋、松弛等皮膚衰老問題。隨著皮膚老化，產(chǎn)生蛋白質(zhì)合成降低，蛋白酶解增加，濕度普遍性降低并且皮膚屏障、結(jié)締組織以及內(nèi)聚性的普遍損壞。

3、膠原蛋白在皮膚中發(fā)揮著非常重要的支撐作用，能夠維持皮膚的緊致度和彈性，尤其是ⅰ型膠原蛋白，它是皮膚中含量最高的膠原蛋白，占總膠原含量的約90％。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，膠原纖維(主要由膠原蛋白構(gòu)成)和彈性纖維(主要由彈力蛋白構(gòu)成)構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有助于增強(qiáng)組織的結(jié)構(gòu)支架和抗拉強(qiáng)度。在纖維之間則分布著大量的水分、細(xì)胞外基質(zhì)和功能性細(xì)胞，是皮膚重要的生化反應(yīng)場所。在皮膚的ecm中，ecm與真皮成纖維細(xì)胞相互作用，膠原纖維支架被不斷重塑。

4、mrna(messenger?rna)是一種在細(xì)胞中起著信息傳遞的作用的核酸分子。它是由基因組dna轉(zhuǎn)錄而來的，在細(xì)胞中參與蛋白質(zhì)合成的過程。相比dna，mrna能介導(dǎo)更優(yōu)的轉(zhuǎn)染效率和更長的蛋白表達(dá)時間。mrna可以指導(dǎo)皮膚細(xì)胞產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)，如膠原蛋白，從而增強(qiáng)皮膚的彈性和保濕能力，減少細(xì)紋和皺紋的出現(xiàn)。

5、經(jīng)查目前，向皮膚內(nèi)的遞送mrna促進(jìn)膠原蛋白增長的相關(guān)技術(shù)尚無深入研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種向皮膚內(nèi)遞送mrna促進(jìn)膠原蛋白增長的方法，實(shí)現(xiàn)mrna經(jīng)皮膚滲透后通過與皮膚細(xì)胞吸收后促進(jìn)膠原蛋白的高效表達(dá)，逆轉(zhuǎn)衰老皮膚受損處的膠原蛋白流失，重新改善受損肌膚的細(xì)胞微環(huán)境，調(diào)節(jié)皮膚狀態(tài)使其達(dá)到肌膚修護(hù)。

2、為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種用于導(dǎo)入皮膚底層以美容的mrna分子，其包含編碼膠原蛋白的核酸序列。

4、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的mrna分子包含編碼膠原蛋白的核酸序列，所述的編碼膠原蛋白的核酸序列含有seq?id?no：1～18中任一項(xiàng)所示的序列。

5、本發(fā)明中，seq?id?no：1～18僅為特征展示序列，根據(jù)mrna技術(shù)特點(diǎn)，理論上所述的膠原蛋白的核苷酸序列也可以為其他種類膠原蛋白的序列。在保持其他條件不變的情況下，表達(dá)其他種類的膠原蛋白，此相關(guān)技術(shù)機(jī)制相同，也能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。

6、本發(fā)明第二方面提供了一種mrna分子，其中，所述的mrna分子包含編碼膠原蛋白的核酸序列，所述的編碼膠原蛋白的核酸序列含有seq?id?no：1～8、seq?id?no：10～17中任一項(xiàng)所示的序列。

7、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的mrna分子包含至少一條編碼i型膠原蛋白α1鏈的mrna序列以及至少一條編碼i型膠原蛋白α2鏈的mrna序列，所述編碼i型膠原蛋白α1鏈的mrna序列具有seq?id?no：1～9中任一所示序列，所述編碼i型膠原蛋白α2鏈的mrna序列具有seq?id?no：10～18中任一所示序列。

8、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述編碼i型膠原蛋白α1鏈的mrna序列具有seq?idno：3所示序列，所述的編碼i型膠原蛋白α2鏈的mrna序列具有seq?id?no：12所示序列。

9、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述編碼i型膠原蛋白α1鏈的mrna序列具有seq?idno：5所示序列，所述的編碼i型膠原蛋白α2鏈的mrna序列具有seq?id?no：14所示序列。

10、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述編碼i型膠原蛋白α1鏈的mrna序列具有seq?idno：3所示序列，所述的編碼i型膠原蛋白α2鏈的mrna序列具有seq?id?no：16所示序列。

11、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的mrna分子的部分或全部核苷可以是化學(xué)修飾的核苷。

12、在本發(fā)明中，所述化學(xué)修飾核苷選自2-氟-2-脫氧腺苷、2-氟-2-脫氧尿苷、2-氟-2-脫氧胞苷、2-氟-2-脫氧鳥苷、2-氟-2-脫氧-5-甲基胞苷、2-氟-2-脫氧-假尿苷、2-氟-2-脫氧-n1-甲基-假尿苷、2-氟-2-脫氧-n7-甲基-鳥苷、2-氟-2-脫氧-5-甲氧基尿苷、2-氟-2-脫氧-n4-乙?；铡?-氟-2-脫氧-n6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、假尿苷、n1-甲基-假尿苷、n7-甲基-鳥苷、5-甲氧基尿苷、n4-乙?；蘸蚽6-甲基腺苷中的一種或幾種。

13、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的mrna分子還具有5'帽結(jié)構(gòu)。

14、在本發(fā)明中，所述的5'帽結(jié)構(gòu)選自m7g、cap0、cap1、cap2、修飾的cap0和修飾的cap1結(jié)構(gòu)中的一種，具體地，可以為cap0、cap1、cap2、arca、肌苷、n1-甲基-鳥苷、2'氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-氧代-鳥苷、2-氨基-鳥苷、lna-鳥苷、2-疊氮基-鳥苷、或?qū)＠暾坈n202310091020.3或cn202310391954.9所提到的5’帽結(jié)構(gòu)中的一種。

15、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的mrna分子還具有polya。

16、在本發(fā)明中，所述polya結(jié)構(gòu)選自cn202211032978.7或cn202311309226.5中所提到的polya中的一種。

17、本發(fā)明第三方面提供了一種美容或藥用組合物，其中，所述的美容或藥用組合物包含本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子。

18、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的美容或藥用組合物還包括醫(yī)學(xué)、美容和化妝品用可接受的基質(zhì)材料。

19、在本發(fā)明中，所述的基質(zhì)材料包括目前常見的與核糖核酸有著良好相容性的基質(zhì)材料，不會引發(fā)核糖核酸成份變性或降解，可以是天然高分子材料中的一種或多種，也可以是人工合成的高分子材料中的一種或多種，也可以是天然高分子材料與人工合成的高分子材料的混合體系。常見的基質(zhì)材料包括但不限于淀粉、植物樹膠、動物明膠，透明質(zhì)酸鈉，透明質(zhì)酸，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素以及瓜耳膠及其衍生物，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸聚合物。

20、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的美容或藥用組合物還包括化妝品學(xué)、食品學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體。

21、在本發(fā)明中，所述載體選自賦形劑、崩解劑、結(jié)合劑、潤滑劑中的一種或多種。

22、所述賦形劑包括但不限于微晶纖維素、乳糖、低取代羥基纖維素或其組合。

23、所述崩解劑包括但不限于淀粉乙醇酸鈉、無水磷酸氫鈣或其組合。

24、所述結(jié)合劑包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙基纖維素、羥丙基纖維素或其組合。

25、所述潤滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、二氧化硅、滑石或其組合。

26、在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述的美容或藥用組合物還包括水、甘油、丙二醇、透明質(zhì)酸鈉、蝦青素、檸檬酸、熊果苷、peg-40、礦油、1.4-丁二醇、棕櫚酸異丙酯、辛酸/癸酸甘油三酯、聚二甲基硅氧烷、peg-60失水山梨醇硬脂酸酯、鯨蠟硬脂醇、聚山梨醇酯-60、甘油硬脂酸酯、苯氧乙醇、羥苯甲酯。

27、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的美容或藥用組合物還進(jìn)一步包括保存劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、溶劑、保濕劑、潤膚劑、紫外線吸收劑、防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑、ph調(diào)節(jié)劑、有機(jī)和無機(jī)顏料、香料、冷感劑或止汗劑。在不損害本發(fā)明的目的和效果的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇諸如上述保濕劑等的附加成分的混合量。

28、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的美容或藥用組合物是無菌的。

29、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的美容或藥用組合物適于局部、經(jīng)皮、皮下、真皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、舌下、經(jīng)頰、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、經(jīng)尿道、吸入、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、心內(nèi)、骨內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)粘膜、玻璃體內(nèi)、視網(wǎng)膜下、關(guān)節(jié)內(nèi)、關(guān)節(jié)周、局部或皮上施用。

30、作為一種優(yōu)選地實(shí)施方式，所述的美容或藥用組合物適于真皮內(nèi)施用和淺表注射。

31、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的美容或藥用組合物可以制成非口服施用劑型。非口服施用劑型可以是注射劑或皮膚外用劑。皮膚外用劑可以是乳膏、凝膠、軟膏、皮膚乳化劑、皮膚懸浮液、經(jīng)皮傳遞性貼片、含藥繃帶、乳液或其組合。

32、所述皮膚外用劑可以根據(jù)需要適當(dāng)混合通常用于化妝品或藥物等的皮膚外用劑的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇類、保濕劑、增稠劑、紫外線吸收劑、美白劑、防腐劑、抗氧化劑、表面活性劑、香料、著色劑以及各種皮膚營養(yǎng)劑等。

33、所述皮膚外用劑可以適當(dāng)混合乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸等的金屬螯合劑、咖啡因、單寧、戊脈安、甘草酸、氨甲環(huán)酸及其衍生物或其鹽等藥劑、維生素c、抗壞血酸磷酸酯鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等的糖類。

34、作為一種優(yōu)選地實(shí)施方式，所述的美容或藥用組合物為皮膚護(hù)理產(chǎn)品。

35、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的美容或藥用組合物還包括以下劑型：化妝水(潤膚液)、柔膚水、爽膚水、收斂劑(astringent)、乳液、牛奶潤膚露(milk?lotion)、保濕乳液、營養(yǎng)液、按摩霜、營養(yǎng)霜、保濕霜、手霜、粉底、精華、營養(yǎng)精華、膜、肥皂、潔面泡沫、潔面乳、潔面霜、身體乳液、身體清潔液、懸浮液、凝膠、粉末、粘膏(paste)、面膜或片裝面膜或噴霧組合物。

36、作為一種優(yōu)選地實(shí)施方式，本發(fā)明所述的美容或藥用組合物為用于射頻導(dǎo)入儀、負(fù)壓導(dǎo)入儀、微晶導(dǎo)入儀、微電流導(dǎo)入儀、微針導(dǎo)入儀、或注射器導(dǎo)入皮膚底層的制劑。

37、本發(fā)明第四方面提供了一種dna分子，其能用于轉(zhuǎn)錄得到本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子。

38、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的dna分子還包括啟動子、3’端連接有utr序列和polya片段，其5’端連接有utr序列和cap。

39、本發(fā)明第五方面提供了一種重組質(zhì)?；蛑亟M細(xì)胞，其包含本發(fā)明第四方面所述的dna分子。

40、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的重組質(zhì)粒的載體為表達(dá)載體。

41、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的重組質(zhì)粒或重組細(xì)胞能用于轉(zhuǎn)錄得到本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna。

42、本發(fā)明第六方面提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子、本發(fā)明第三方面所述的美容或藥用組合物、本發(fā)明第四方面所述的dna分子、或本發(fā)明第五方面所述的重組質(zhì)粒或重組細(xì)胞。

43、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的試劑盒為用于制備本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子的試劑盒。所述的用于制備本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子的試劑盒包含本發(fā)明第三方面所述的dna分子、或本發(fā)明第四方面所述的重組質(zhì)?；蛑亟M細(xì)胞。

44、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的試劑盒為用于皮膚護(hù)理或改善皮膚狀態(tài)的試劑盒。所述的用于皮膚護(hù)理或改善皮膚狀態(tài)的試劑盒包含本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子或本發(fā)明第三方面所述的美容或藥用組合物。

45、作為一種優(yōu)選地實(shí)施方式，本發(fā)明所述的用于皮膚護(hù)理或改善皮膚狀態(tài)的試劑盒還包含輔助導(dǎo)入設(shè)備。

46、在本發(fā)明中，輔助導(dǎo)入設(shè)備促進(jìn)mrna分子通過皮膚進(jìn)入皮膚底層，達(dá)到有效遞送的目的；其中所述的輔助導(dǎo)入設(shè)備根據(jù)其作用機(jī)制不同主要分為射頻導(dǎo)入儀、負(fù)壓導(dǎo)入儀、微晶導(dǎo)入儀、微電流導(dǎo)入儀、微針導(dǎo)入儀、注射器。

47、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的輔助導(dǎo)入設(shè)備包括負(fù)壓導(dǎo)入儀、微電流導(dǎo)入儀、微針導(dǎo)入儀。更為優(yōu)選的，所述的輔助導(dǎo)入設(shè)備為微針導(dǎo)入儀。

48、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的輔助導(dǎo)入設(shè)備為注射器。

49、本發(fā)明第七方面提供了一種制備本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子的方法，其包括：

50、(1)將本發(fā)明第四方面所述的dna分子克隆至表達(dá)質(zhì)粒獲得重組質(zhì)粒；

51、(2)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞獲得重組細(xì)胞，從擴(kuò)增后的重組細(xì)胞中提取質(zhì)粒，以提取獲得的質(zhì)粒為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得體外表達(dá)mrna的dna模板；

52、(3)構(gòu)建包括所述dna模板的rna體外合成體系進(jìn)行mrna的體外合成獲得所述的mrna分子。

53、在本發(fā)明中，當(dāng)所述的mrna分子為包含編碼i型膠原蛋白α1鏈的mrna序列的mrna分子和包含編碼i型膠原蛋白α2鏈的mrna序列的mrna分子的混合物時，將上述獲得的mrna分子按比例混合即可得到該混合物。

54、在本發(fā)明中，合成轉(zhuǎn)錄所述的mrna的dna片段，并將所述dna片段克隆至表達(dá)質(zhì)粒獲得重組質(zhì)粒。本發(fā)明對合成所述的mrna對應(yīng)的dna片段的方法沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域常規(guī)的dna合成方法即可，在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，優(yōu)選的委托生物技術(shù)公司合成。

55、在本發(fā)明中，優(yōu)選的通過酶切連接的方法將所述dna片段克隆至表達(dá)質(zhì)粒中；在本發(fā)明中，所述dna片段優(yōu)選的通過bamhi和nhei酶進(jìn)行雙酶切獲得酶切dna片段；所述表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選的通過bamhi和nhei酶進(jìn)行雙酶切后獲得酶切質(zhì)粒；然后將所述酶切dna片段和酶切質(zhì)粒連接獲得重組質(zhì)粒。

56、本發(fā)明在獲得所述重組質(zhì)粒后，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞獲得重組細(xì)胞，從擴(kuò)繁后的重組細(xì)胞中提取質(zhì)粒，以提取獲得的質(zhì)粒為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得體外表達(dá)mrna的dna模板。在本發(fā)明中，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；

57、本發(fā)明在獲得重組細(xì)胞后，優(yōu)選的進(jìn)行陽性重組細(xì)胞的篩選和菌落測序。在本發(fā)明中，所述陽性重組細(xì)胞的篩選優(yōu)選的在amp抗性的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行。在本發(fā)明中，挑選所述amp抗性的固體培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行菌落pcr，選取菌落pcr結(jié)果含目的條帶的菌落進(jìn)行測序。本發(fā)明對所述菌落pcr的具體步驟沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域常規(guī)的菌落pcr步驟即可。

58、在本發(fā)明中，提取測序正確的重組細(xì)胞的質(zhì)粒；本發(fā)明對所述質(zhì)粒的提取方法沒有特殊限定，優(yōu)選的采用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行。在本發(fā)明中，以提取獲得的質(zhì)粒為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得體外表達(dá)mrna的dna模板。所述dna模板的濃度優(yōu)選為1ng/μl。在本發(fā)明中，所述pcr的擴(kuò)增程序優(yōu)選的如下：預(yù)變性98℃3分鐘；變性98℃10秒，退火60℃5秒，延伸72℃2分鐘，34個循環(huán)；最后延伸72℃，10分鐘。

59、在本發(fā)明中，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選的對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測以確定反應(yīng)是否成功；所述瓊脂糖凝膠電泳檢測的參數(shù)優(yōu)選的如下：1.5％瓊脂糖，5v/min，40分鐘。在本發(fā)明中，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)目的大小的條帶認(rèn)為是反應(yīng)成功。

60、本發(fā)明在所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選的將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃縮和純化。在本發(fā)明中，所述濃縮優(yōu)選的采用millipore?30kd超濾管進(jìn)行；所述純化優(yōu)選的采用fplc進(jìn)行；本發(fā)明在所述純化后優(yōu)選的采用nano?drop檢測純化后模板的濃度，以及260/280、260/230的比值。優(yōu)選260/280范圍為1.8-2.1，260/230范圍為大于2.0。

61、本發(fā)明在獲得所述dna模板后，構(gòu)建包括所述dna模板的rna體外合成體系進(jìn)行mrna的體外合成獲得所述活性成分mrna。在本發(fā)明中，所述rna體外合成體系以1600μl計(jì)，包括以下組分：

62、

63、在本發(fā)明中，所述rna體外合成的條件優(yōu)選的為36～38℃，8～12小時，更優(yōu)選為37℃，10小時。在本發(fā)明中，所述rna體外合成優(yōu)選的在恒溫反應(yīng)器中進(jìn)行；所述rna體外合成體系優(yōu)選的置于2ml?rnase-free?tube管中，一次同時反應(yīng)多管；所述rna體外合成體系中的反應(yīng)試劑按照上述順序添加。

64、本發(fā)明在所述rna體外合成結(jié)束后，優(yōu)選的還包括去除dna模板、回收mrna和純化mrna的步驟。在本發(fā)明中，所述去除dna模板優(yōu)選的通過dnase?i消化實(shí)現(xiàn)；所述消化優(yōu)選的包括將dnase?i與rna體外合成反應(yīng)后的溶液混合后進(jìn)行；所述dnase?i與rna體外合成反應(yīng)后的溶液的體積比優(yōu)選為3:40；所述混合優(yōu)選的通過上下顛倒所述rnase-free?tube管實(shí)現(xiàn)，所述上下顛倒的次數(shù)優(yōu)選為8～12次，更優(yōu)選為10次；本發(fā)明在所述混合后，優(yōu)選的進(jìn)行離心將溶液收集至rnase-free?tube管底部。在本發(fā)明中，所述離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為800～1200rpm，更優(yōu)選為1000rpm；所述離心的時間優(yōu)選為8～12秒，更優(yōu)選為10秒。所述消化的溫度優(yōu)選為37℃；所述消化的時間優(yōu)選為1小時。

65、本發(fā)明在所述消化結(jié)束后，優(yōu)選的進(jìn)行dna片段殘留檢測。在本發(fā)明中，所述回收mrna優(yōu)選的通過將所述醋酸銨溶液沉淀實(shí)現(xiàn)；具體實(shí)施方法參見實(shí)施例記載；本發(fā)明在回收mrna后，進(jìn)行mrna的質(zhì)量檢測；所述質(zhì)量檢測包括mrna的濃度、mrna的260/280、260/230的比值，純mrna的a260/a280的值為2.0～2.1，a260/a230范圍為1.8～2.2。在本發(fā)明中，所述純化mrna通過hplc純化實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所述純化mrna后，優(yōu)選的對純化后的mrna進(jìn)行分裝。

66、本發(fā)明第八方面提供了一種美容方法，其包括向皮膚施用本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子、或本發(fā)明第三方面所述的美容或藥用組合物。

67、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的方法還包括借由輔助導(dǎo)入設(shè)備促進(jìn)mrna分子通過皮膚進(jìn)入皮膚底層，達(dá)到有效遞送的目的；其中所述的輔助導(dǎo)入設(shè)備根據(jù)其作用機(jī)制不同主要分為射頻導(dǎo)入儀、負(fù)壓導(dǎo)入儀、微晶導(dǎo)入儀、微針導(dǎo)入儀、注射器。

68、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的輔助導(dǎo)入設(shè)備包括負(fù)壓導(dǎo)入儀、微電流導(dǎo)入儀、微針導(dǎo)入儀。更為優(yōu)選地，所述的輔助導(dǎo)入設(shè)備為微針導(dǎo)入儀。

69、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的輔助導(dǎo)入設(shè)備為注射器。

70、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的mrna分子的工作濃度為0.001ng/ml-10mg/ml。

71、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的mrna分子的工作濃度為0.01μg/ml-1.0mg/ml。

72、作為一種更為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的mrna分子的工作濃度為0.01?-1.0μg/ml。

73、作為一種優(yōu)選地實(shí)施方式，所述的mrna分子的工作濃度為1.0mg/ml。

74、作為一種更為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的mrna分子的工作濃度為0.01μg/ml。

75、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的美容方法有助于改善皮膚皺紋，所針對的皮膚皺紋是指淺表凹陷所形成的鼻唇皺褶、魚尾紋、皺眉紋、煩惱紋、疤痕、眉間紋、眉下垂、淚槽、鼻頰紋、兔寶寶紋、面頰/面中部下垂、木偶紋、罌粟陷窩、微笑紋、笑紋、下巴皺痕、頸紋、頸闊肌帶以及它們的任何組合。

76、本發(fā)明第九方面提供了本發(fā)明第一方面或第二方面所述的mrna分子、本發(fā)明第三方面所述的美容或藥用組合物、本發(fā)明第四方面所述的dna分子、本發(fā)明第五方面所述的重組質(zhì)粒或重組細(xì)胞、或本發(fā)明第六方面所述的試劑盒在制備用于皮膚護(hù)理或改善皮膚狀態(tài)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

77、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的產(chǎn)品為藥物、化妝品或試劑盒。

78、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的改善皮膚狀態(tài)為促進(jìn)膠原蛋白的表達(dá)。

79、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述的改善皮膚狀態(tài)為刺激膠原纖維增生。

80、有益效果：

81、本發(fā)明提供了一種mrna分子及其用途，所述mrna分子包含編碼膠原蛋白的核酸序列。本發(fā)明構(gòu)建的mrna序列在很大程度上避免了在哺乳動物細(xì)胞中的序列非依賴性凋亡，顯示出更好的血清穩(wěn)定性和提高的體內(nèi)活性。本發(fā)明還涉及醫(yī)學(xué)、美容和化妝品組合物的應(yīng)用，利用脂質(zhì)體或者其他基因?qū)爰夹g(shù)，將組合物導(dǎo)入皮膚細(xì)胞或被皮膚細(xì)胞吸收后通過mrna翻譯蛋白質(zhì)的生物學(xué)機(jī)理，使得皮膚細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，通過使皮膚組織中膠原蛋白含量的上調(diào)從而將老化皮膚正?；?，本發(fā)明提供的美容組合物制劑制備方法簡單、快速、活性成分表達(dá)量高，結(jié)合本發(fā)明中的藥物導(dǎo)入方法能夠增強(qiáng)mrna制劑導(dǎo)入皮膚的效率，提高有效制劑的利用率，從而達(dá)到更有效的皮膚透皮遞送的目的，達(dá)到皮膚修護(hù)的效果。

82、本發(fā)明提供的mrna劑型的化妝品制劑，包括具有刺激膠原蛋白再生的mrna，將所述制劑導(dǎo)入皮膚細(xì)胞后能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白的表達(dá)，彌補(bǔ)了因衰老、光照、水分流失等造成的皮膚褶皺等情況，具體實(shí)施例中數(shù)據(jù)展示了有效性數(shù)據(jù)；根據(jù)實(shí)施例的記載，本發(fā)明提供的具有刺激膠原蛋白生長因子mrna能夠在細(xì)胞內(nèi)特異性的高水平表達(dá)；本發(fā)明在使用過程中結(jié)合輔助設(shè)備如射頻導(dǎo)入儀、負(fù)壓導(dǎo)入儀、微晶導(dǎo)入儀、微電流導(dǎo)入儀等突破皮膚吸收屏障激活自體膠原蛋白表達(dá)，解決其他護(hù)膚品不易透過表皮的現(xiàn)象，刺激膠原纖維增生、保障皮膚組織完整性，使皮膚緊致、細(xì)紋淡化、美白補(bǔ)水、淡化色素，使皮膚白晳透亮，而且有自體細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，不會刺激皮膚，因此可安全使用。