本發(fā)明涉及使用rna調(diào)控suv39h1表達(dá)的組合物和方法。

背景技術(shù)：

1、長(zhǎng)鏈非編碼rna(lncrna)是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，參與許多細(xì)胞過程。它們的表達(dá)已被發(fā)現(xiàn)特別具有組織特異性或發(fā)育階段特異性(ahmad等人，2021年)。

2、小發(fā)夾rna(shrna)是rna序列，長(zhǎng)度通常約為80個(gè)堿基對(duì)，其包括產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)的內(nèi)部雜交區(qū)域。shrna分子在細(xì)胞內(nèi)被加工以形成sirna，其轉(zhuǎn)而敲低基因表達(dá)。shrna的益處在于它們可以被摻入質(zhì)粒載體并整合到基因組dna中，以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期或穩(wěn)定的表達(dá)，從而長(zhǎng)期敲低靶mrna。

3、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶通過對(duì)核小體處的組蛋白分子進(jìn)行翻譯后修飾，促進(jìn)染色質(zhì)重排為常染色質(zhì)(開放、轉(zhuǎn)錄活躍的染色質(zhì))和異染色質(zhì)(封閉、非活性染色質(zhì))。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶積極控制基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)。suv39h1是首批被鑒定的甲基轉(zhuǎn)移酶之一(aagaard等人，1999年)。其已被證明參與許多發(fā)育過程，特別是免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程(rao等人，2017年；nicetto和zaret，2019年；allan等人，2012年；pace等人，2018年)。

4、pace等人，2018年和國際專利公開wo?2018/234370公開了抑制t細(xì)胞和nk細(xì)胞中suv39h1的表達(dá)增強(qiáng)其記憶潛能并提高存活能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開提供了使用rna調(diào)控suv39h1表達(dá)的組合物和方法。

2、本發(fā)明涉及一種細(xì)胞，其包含第一核酸，該第一核酸是表達(dá)rna的異源核酸，包含[seq?id?no：1]的核堿基序列(lncrna?af196970.3)或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段；包含[seq?id?no：5]的核苷酸序列(編碼af196970.3的基因組序列(ensg00000232828))或其片段的異源核酸，該片段表達(dá)能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的rna；表達(dá)rna的核酸，包含[seq?id?no：1]的核堿基序列(lncrna?af196970.3)或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段，所述核酸可操作地連接到異源表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、其他調(diào)控序列)；或者可操作地連接到異源表達(dá)控制序列的核酸，包含[seq?id?no：5]的核苷酸序列(編碼af196970.3的基因組序列(ensg00000232828))或其表達(dá)能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的rna的片段，所述核酸可操作地連接到異源表達(dá)控制序列。第一核酸可以包含seq?id?no：5-9中任何一個(gè)的核苷酸序列或其片段。第一核酸可以表達(dá)rna，包含[seq?id?no：2]的核堿基序列(lncrna?af196970.3外顯子1)或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段。第一核酸可以表達(dá)rna，包含[seq?id?no：3]的核堿基序列(lncrna?af196970.3外顯子2)或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段。第一核酸可以表達(dá)rna，包含[seq?id?no：4]的核堿基序列(lncrna?af196970.3外顯子3)或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段。在任何前述實(shí)施方式中，第一核酸可以表達(dá)長(zhǎng)度至少約12-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、250-750、500-750或更多個(gè)堿基的rna。

3、本發(fā)明還涉及一種包含核酸的細(xì)胞，該核酸是異源核酸，其表達(dá)rna，包含seq?idno：13-17或seq?id?no：26-30中任何一個(gè)的核苷酸序列或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段或衍生物；或其表達(dá)能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的rna的片段；表達(dá)rna的核酸，包含seq?id?13-17或seq?id?no：26-30中任何一個(gè)的核苷酸序列或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段，所述核酸通?？刹僮鞯剡B接到異源表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、其他調(diào)控序列)。核酸可以包含seq?id?no：13-17或26-30中任何一個(gè)的核苷酸序列或其片段。

4、本發(fā)明還涉及一種細(xì)胞，其包含異源多核苷酸，該異源多核苷酸包含seq?id?no：32-36和45-49中任何一個(gè)的核苷酸序列或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段。在一些實(shí)施方式中，所述核酸可以可操作地連接到異源表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、其他調(diào)控序列)。

5、細(xì)胞可以是經(jīng)修飾的免疫細(xì)胞。

6、細(xì)胞可以是以下任何細(xì)胞類型：t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、cd4+和cd8+t細(xì)胞、nk細(xì)胞、treg細(xì)胞、tm細(xì)胞、記憶干t細(xì)胞(tscm)、tcm細(xì)胞、tem細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞祖細(xì)胞、nk細(xì)胞祖細(xì)胞、多能干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)、造血干細(xì)胞(hsc)、脂肪干細(xì)胞(adsc)、髓系或淋巴系多能干細(xì)胞。

7、細(xì)胞可以包含一種或多種工程化受體，兩種或更多種，或者三種或更多種。

8、細(xì)胞可以包含表達(dá)一種或多種工程化受體的第二異源核酸。工程化受體可以包含a)特異性結(jié)合抗原的胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，任選地包含抗體重鏈可變區(qū)和/或抗體輕鏈可變區(qū)，并且可以任選地是雙特異性或三特異性的；b)跨膜結(jié)構(gòu)域，任選地包含t細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd34、cd137或cd154、nkg2d、ox40、icos、2b4、dap10、dap12、cd40的跨膜結(jié)構(gòu)域片段；c)任選地來自4-1bb、cd28、icos、ox40、dap10或dap12、2b4、cd40、fcer1g的一個(gè)或多個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域；以及d)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，包含來自cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cds、cd22、cd79a、cd79b或cd66d、2b4的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或其任何片段。工程化受體可以是嵌合抗原受體(car)，包含胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(任選地scfv)、跨膜結(jié)構(gòu)域(任選地來自cd28、cd8或cd3ζ)、一個(gè)或多個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域(任選地來自4-1bb、cd28、icos、ox40或dap10)以及來自cd3ζ的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，任選地其中itam2和itam3已被失活。

9、工程化受體也可以是經(jīng)修飾的tcr。

10、經(jīng)修飾的tcr可以包含(a)包含抗體的抗原結(jié)合片段或cdr的胞外結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選重鏈可變區(qū)(vh)和/或輕鏈可變區(qū)(vl)的所有三個(gè)cdr，以及(b)α、β、γ或δ鏈的天然或變異恒定區(qū)。例如，經(jīng)修飾的tcr可以包含一種或多種異源多肽，例如(a)與trbc1(通常是人或鼠trbcl)或trbc2(通常是人或鼠trbc2)融合的抗體的vh或與其具有至少90％序列同一性的片段或變體，或者與其具有至少90％序列同一性的trbc1或trbc2的片段或變體，以及(b)與trac(人或鼠trac序列)融合的抗體的vl或與其具有至少90％序列同一性的片段或變體，或者與其具有至少90％序列同一性的trac的片段或變體。經(jīng)修飾的tcr還可以任選地包含天然或變體cd3ζ多肽，例如其中一個(gè)或兩個(gè)itam結(jié)構(gòu)域(例如itam2和itam3)已經(jīng)缺失的經(jīng)修飾的cd3ζ多肽。

11、以hla非依賴性方式與感興趣的抗原結(jié)合的重組hla非依賴性(或非hla限制性)經(jīng)修飾tcr(稱為“hi-tcr”)代表性地在國際申請(qǐng)wo?2019/157454中描述。此類hi-tcr包含抗原結(jié)合鏈，該抗原結(jié)合鏈包含：(a)以hla非依賴方式與抗原結(jié)合的異源抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如免疫球蛋白可變區(qū)的抗原結(jié)合片段；和(b)能夠與cd3ζ多肽締合(并因此激活)的恒定結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其片段包含：(i)抗體的重鏈可變區(qū)(vh)和/或(ii)抗體的輕鏈可變區(qū)(vl)。tcr的恒定結(jié)構(gòu)域是例如天然或經(jīng)修飾的trac多肽(通常是人或鼠trac序列)，或者天然或經(jīng)修飾的trbc多肽(通常是人或鼠trbc序列)。tcr的恒定結(jié)構(gòu)域是例如(人或鼠)天然tcr恒定結(jié)構(gòu)域(α或β)或其片段。與通常自身包含胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體不同，hi-tcr不直接產(chǎn)生激活信號(hào)；相反，抗原結(jié)合鏈與cd3ζ多肽締合并因此激活cd3ζ多肽。當(dāng)抗原在細(xì)胞表面上的密度較低(通常是中值密度)，每個(gè)細(xì)胞少于約10000個(gè)分子，例如每個(gè)細(xì)胞少于約5000、4000、3000、2000、1000、500、250或100個(gè)分子時(shí)，包含重組tcr的免疫細(xì)胞提供優(yōu)異的活性。

12、因此，工程化受體通常可以是經(jīng)修飾的tcr，包含第一抗原結(jié)合鏈和第二抗原結(jié)合鏈，該第一抗原結(jié)合鏈包含抗體重鏈可變區(qū)(vh)的抗原結(jié)合片段，該第二抗原結(jié)合鏈包含抗體輕鏈可變區(qū)(vl)的抗原結(jié)合片段；其中第一抗原結(jié)合鏈和第二抗原結(jié)合鏈各自包含trac多肽或trbc多肽，任選地其中trac多肽和trbc多肽中的至少一個(gè)是內(nèi)源性的，并且任選地其中內(nèi)源性trac多肽和trbc多肽中的一個(gè)或兩個(gè)被失活。

13、細(xì)胞還可以包含嵌合共刺激受體，該嵌合共刺激受體包含(a)cd86、41bbl、cd275、cd40l、ox40l、pd-1、tigit、2b4或nrp1的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域，或者其片段或變體，和(b)cd28、4-1bb、0x40、icos、cd27、cd40或cd2的胞內(nèi)共刺激分子，或者其片段或變體。在一些實(shí)施方式中，嵌合共刺激受體包含(a)共刺激配體的胞外結(jié)構(gòu)域，任選地來自cd80，(b)跨膜結(jié)構(gòu)域，任選地來自cd80，和(c)共刺激分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，任選cd28、4-1bb、ox40、icos、dap10、cd27、cd40、nkgd2或cd2，優(yōu)選4-1bb。

14、細(xì)胞的胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以以約1?x?10-7或更低、約5?x?10-8或更低、約1?x10-8或更低、約5?x?10-9或更低、約1?x?10-9或更低、約5?x?10-10或更低、約1?x?10-10或更低、約5?x?10-11或更低、約1?x?10-11或更低、約5?x?10-12或更低或約1?x?10-12或更低(數(shù)字越低表示親和力越高)的kd親和力結(jié)合抗原。胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗原在細(xì)胞表面上的密度可以較低，為每個(gè)細(xì)胞少于約10000個(gè)分子，或少于約5000個(gè)分子，或少于約2000個(gè)分子。

15、胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與抗原結(jié)合，例如，

16、孤兒酪氨酸激酶受體ror1、tegfr、her2、p95her2、li-cam、cd19、cd20、cd22、間皮素、cea、緊密連接蛋白18.2、乙型肝炎表面抗原、抗葉酸受體、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、cd70、egfr、egp-2、egp-4、epha2、erbb2、erbb3或erbb4、fbp、fcrh5、胎兒乙酰膽堿e受體、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、k輕鏈、bcma、lewis?y、mage-a1、間皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配體、ny-eso-1、mart-1、gp100、瘤胎抗原、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特異性抗原(psma)、雌激素受體、孕酮受體、ephrinb2、cd?123、cs-1、c-met、gd-2、mage?a3、ce7或wilms腫瘤1(wt-1)。在一些實(shí)施方式中，抗原可以是國際專利公開wo?2021/043804、wo?2022/189620、wo?2022/189626、wo?2022/189636(其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文)中公開的任何腫瘤新抗原肽。

17、細(xì)胞可以包含兩種工程化抗原受體，每種受體結(jié)合不同的抗原。

18、細(xì)胞可以是自體的或同種異體的。

19、細(xì)胞中suv39h1的表達(dá)可以被減少或抑制至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

20、細(xì)胞最初可以從患有癌癥或面臨患癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者中分離出來。

21、本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的寡核苷酸，包含長(zhǎng)度至少約12個(gè)堿基的來自[seq?id?no：1-4]中任何一個(gè)的核堿基序列，其中經(jīng)修飾的寡核苷酸包含經(jīng)修飾的骨架連接、經(jīng)修飾的糖部分、經(jīng)修飾的磷酸部分、經(jīng)修飾的核堿基或化學(xué)共軛部分中的一種或多種。經(jīng)修飾的寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是至少約12-50、50-75或50-100個(gè)堿基。經(jīng)修飾的寡核苷酸可以包含經(jīng)修飾的骨架連接，其包含硫代磷酸酯、膦?；宜狨?、硫代膦酰基乙酸酯、甲基膦酸酯、硼基磷酸酯或二硫代磷酸酯部分。經(jīng)修飾的寡核苷酸可以包含經(jīng)修飾的糖，其被修飾以用另一個(gè)基團(tuán)替換2’oh-基團(tuán)，該另一個(gè)基團(tuán)任選地是h、-or、-r(其中r可以是，例如，烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、鹵素、-f、-br、-cl或-i、-sh、-sr(其中r可以是，例如，烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、-阿拉伯糖、f-阿拉伯糖、氨基(其中氨基可以是，例如，nh2；烷基氨基、二烷基氨基、雜環(huán)基、芳基氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基、二雜芳基氨基或氨基酸)；或氰基(-cn)；任選地2’-o-甲氧基、2’-o-甲氧基乙基修飾、2’-氟、2’-脫氧或其組合。經(jīng)修飾的寡核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核堿基，其包含一種或多種5-甲基胞嘧啶、經(jīng)修飾的尿苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷和5-溴尿苷、經(jīng)修飾的腺苷和鳥苷，例如在位置8進(jìn)行修飾，例如8-溴鳥苷、脫氮核苷酸，例如7-脫氮腺苷，或o-和n-烷基化的核苷酸，例如n6-甲基腺苷，或多環(huán)的經(jīng)修飾的核苷酸(例如三環(huán)；和“解鎖(unlocked)”形式，例如乙二醇核酸(gna)(例如r-gna或s-gna，其中核糖被連接到磷酸二酯鍵的乙二醇單元取代)，或蘇糖核酸(tna，其中核糖被α-l-蘇呋喃糖基-(3’→2’)取代)。

22、本發(fā)明還涉及一種可操作地連接到異源表達(dá)控制序列的核酸，所述核酸包含(a)編碼或表達(dá)rna的核苷酸序列，其包含[seq?id?no：1]的核堿基序列(lncrna?af196970.3)或seq?id?no：13-17和26-30中任何一個(gè)的核苷酸序列或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段，或(b)[seq?id?no：5]的核苷酸序列(編碼af196970.3的基因組序列(ensg00000232828))或seq?id?no：32-36和45-49中任何一個(gè)的核苷酸序列或其表達(dá)能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的rna的片段。核酸可以包含seq?id?no：5-9、32-36、42-49中任何一個(gè)的核苷酸序列或其一個(gè)片段或多個(gè)片段。異源控制序列可以是組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子，任選地是ef1α、cmv、sffv、hpgk、rpbsa或cag。

23、本發(fā)明還涉及一種包含本文所述的核酸和一個(gè)或多個(gè)附加的表達(dá)控制序列的載體。載體是病毒載體，任選地是腺病毒、腺相關(guān)病毒(aav)、痘病毒、乳頭瘤病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、泡沫病毒或塞姆利基森林(semliki?forest)病毒載體，并且包括假型病毒。

24、本發(fā)明還涉及一種遞送媒介物，任選地為脂質(zhì)體、含脂質(zhì)的復(fù)合物、納米顆粒、金顆?；虬鲜龊怂峄蜉d體的聚合物復(fù)合物。

25、本發(fā)明還涉及一種制備本文所述細(xì)胞的方法，至少包括以下步驟：(a)將(i)本文所述的核酸或(ii)本文所述的載體引入細(xì)胞，以及任選地(b)將編碼抗原特異性受體的核酸引入細(xì)胞。

26、本發(fā)明還涉及一種制備本文所述細(xì)胞的方法，至少包括以下步驟：將異源表達(dá)控制序列以使得其可操作地連接到表達(dá)rna的內(nèi)源性核酸的方式引入細(xì)胞，該內(nèi)源性核酸包含[seq?id?no：1]的核堿基序列(lncrna?af196970.3)，或seq?id?no：13-17、26-30中任何一個(gè)的核苷酸序列或其能夠抑制細(xì)胞中suv39h1表達(dá)的片段，任選地是包含[seq?id?no：5]的核苷酸序列(編碼af196970.3(ensg00000232828)的基因組序列或其等位基因變體)或seq?id?no：32-36和45-49中任何一個(gè)的核苷酸序列的核酸。

27、本發(fā)明還涉及一種使用本文所述的細(xì)胞治療疾病的方法，包括向有需要的受試者施用有效治療疾病、任選癌癥、傳染病、自身免疫性疾病、炎癥性疾病或過敏性疾病的量的細(xì)胞，其中細(xì)胞表達(dá)一種或多種結(jié)合與疾病相關(guān)的抗原的抗原特異性受體。

28、本發(fā)明還涉及一種治療患有癌癥的受試者的方法，包括向所述受試者施用：(1)本文所述的細(xì)胞；和(2)第二癌癥治療劑。第二癌癥治療劑可以是免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑、癌癥疫苗、化學(xué)治療劑或抗血管生成劑。

29、本發(fā)明還涉及一種治療患有癌癥的受試者的方法，包括向所述受試者施用：(1)本文所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞是t細(xì)胞、nk細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞，其包含遺傳工程化的抗原受體，其中suv39h1基因的表達(dá)受到抑制，并且其中suv39h1基因的抑制導(dǎo)致所述免疫細(xì)胞的抗癌活性增強(qiáng)；和(2)免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑。免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑可以是pd1、ctla4、lag3、btla、ox2r、tim-3、tigit、lair-1、pge2受體、ep2/4腺苷受體或a2ar的抑制劑。免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑可以是抗pd-1抑制劑或抗pdl-1抑制劑。