本發(fā)明特別涉及用于克隆擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列(soi)的方法、結(jié)合這些方法的核苷酸測(cè)序方法、以及包括克隆擴(kuò)增的核苷酸序列的表面。

背景技術(shù)：

1、在固相測(cè)序工作流程中，一般通過(guò)固定在表面(例如載玻片、珠子或微流體系統(tǒng)中的特征組件)上的寡核苷酸捕獲各個(gè)目標(biāo)核苷酸片段。然后對(duì)束縛(tethered)分子進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。這使得特別是可以使用極少量的材料、必要流體的簡(jiǎn)單控制、以及能夠在小空間內(nèi)布置許多類(lèi)似的反應(yīng)。在最近的核苷酸測(cè)序方法中，將測(cè)序引物退火到束縛序列上，并且隨著引物的延伸，檢測(cè)依次摻入的各個(gè)堿基(摻入信號(hào))，例如通過(guò)熒光或者檢測(cè)反應(yīng)中產(chǎn)生的離子進(jìn)行檢測(cè)。為了使摻入信號(hào)增強(qiáng)，可以將單個(gè)束縛分子擴(kuò)增以產(chǎn)生源自單個(gè)多核苷酸的束縛擴(kuò)增子的克隆簇。這種“克隆擴(kuò)增”(ca)提供了很多重復(fù)的測(cè)序靶標(biāo)，因此允許在簇內(nèi)同時(shí)發(fā)生多個(gè)摻入事件，從而多次放大信號(hào)。已經(jīng)知道多種ca方法，并且這些方法已經(jīng)得到開(kāi)發(fā)和商業(yè)化應(yīng)用，例如用于測(cè)序工作流程中。這些方法包括橋式pcr(us9593328)、乳液pcr(us20100261230a1)和動(dòng)力學(xué)排除擴(kuò)增法(us9169513)。通過(guò)重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)進(jìn)行克隆擴(kuò)增的方法也已被報(bào)道并在共同待決的申請(qǐng)gb2110479.9中進(jìn)行了論述，在下文中進(jìn)一步論述。

2、盡管ca方法通常會(huì)提供增強(qiáng)的信號(hào)，但在某些情況下，信號(hào)的水平和/或其高于背景的水平可能仍然具有挑戰(zhàn)性。優(yōu)化特定的ca方法能提高束縛擴(kuò)增子的密度，但是密度(以及相應(yīng)的信號(hào))可能仍然會(huì)受到一些因素的限制，例如固定在表面上的捕獲寡核苷酸的密度以及空間考慮因素使克隆擴(kuò)增期間聚合酶與局部擁擠分子接觸的機(jī)會(huì)減少。此外，增加束縛簇內(nèi)的核苷酸或靶標(biāo)密度的方法可能也會(huì)影響簇?cái)U(kuò)散，并且可能會(huì)增加由鄰近擴(kuò)增事件所致的污染發(fā)生率并降低克隆性，妨礙讀取質(zhì)量，使背景增強(qiáng)并對(duì)信噪比產(chǎn)生不利的影響，尤其是在簇的邊界周?chē)侨绱?。通過(guò)增加克隆簇的密度，還有可能減少各個(gè)簇所占據(jù)的空間，從而為增加給定區(qū)域內(nèi)的簇?cái)?shù)量提供余地，而不會(huì)使各個(gè)簇產(chǎn)生的信號(hào)減弱。

3、在一些情況下，例如要通過(guò)測(cè)序來(lái)確定序列內(nèi)的多態(tài)性、或者要確定樣本內(nèi)特定的核苷酸序列的存在時(shí)，可能需要基于已知或部分已知的序列提供簇。在一些情況下，例如要對(duì)基因組片段進(jìn)行測(cè)序以便稍后組裝、或者要確定其他未知的核苷酸序列時(shí)，可能需要提供未知序列的克隆簇。

4、因此，希望提供改進(jìn)的克隆擴(kuò)增方法。還希望在克隆擴(kuò)增時(shí)不會(huì)對(duì)克隆性、簇?cái)U(kuò)散或信噪比產(chǎn)生不利的影響。還希望提供一種克隆擴(kuò)增方法，該方法能夠容易地適應(yīng)已知、部分已知或未知序列的應(yīng)用。本發(fā)明解決了上述問(wèn)題中的一個(gè)或以上的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備目標(biāo)核苷酸序列的克隆簇的方法，包括：(i)提供包括目標(biāo)核苷酸序列(soi)的單鏈多核苷酸，其中該多核苷酸通過(guò)其5'端束縛于表面；(ii)對(duì)單鏈多核苷酸進(jìn)行第一次克隆擴(kuò)增，以提供第一多核苷酸簇，該第一多核苷酸簇包括多條通過(guò)各自的5'端束縛于所述表面并且包括目標(biāo)核苷酸序列的單鏈多核苷酸；以及(iii)通過(guò)進(jìn)一步添加目標(biāo)核苷酸序列的一個(gè)或以上的拷貝以延伸第一簇中的束縛單鏈多核苷酸，以提供束縛多核苷酸的簇，其中所述簇中的多核苷酸包括目標(biāo)核苷酸序列的多個(gè)拷貝。

2、第二實(shí)施方案提供了一種制備包括目標(biāo)序列的單鏈多核苷酸的克隆簇的方法，該方法包括：使多核苷酸片段與捕獲寡核苷酸雜交，該多核苷酸片段包括目標(biāo)序列的互補(bǔ)拷貝，該捕獲寡核苷酸通過(guò)其5′端束縛于表面；(ii)使用聚合酶延伸該捕獲寡核苷酸的3′端，以提供包括目標(biāo)序列的單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸通過(guò)其5'端束縛于所述表面；(iii)對(duì)束縛單鏈多核苷酸進(jìn)行第一次克隆擴(kuò)增，以提供第一多核苷酸簇，該第一多核苷酸簇包括多條通過(guò)各自的5'端束縛于所述表面并且包括目標(biāo)核苷酸序列的單鏈多核苷酸；以及(iii)通過(guò)進(jìn)一步添加目標(biāo)序列的一個(gè)或以上的拷貝來(lái)延伸第一簇中的束縛單鏈多核苷酸的3'端，以提供束縛多核苷酸的簇，其中所述簇中的多核苷酸包括目標(biāo)核苷酸序列的多個(gè)拷貝。

3、在一個(gè)方面中，多核苷酸通過(guò)5'末端部分與捕獲寡核苷酸雜交。多核苷酸可以配備有3'銜接子以及可選地配備有5'銜接子，并且3′銜接子的至少一部分與捕獲寡核苷酸雜交。

4、在第三實(shí)施方案中，提供了一種用于確定目標(biāo)序列的核苷酸序列的方法，包括：(i)將目標(biāo)序列通過(guò)其5'端束縛于表面；(ii)執(zhí)行第一次克隆擴(kuò)增步驟以克隆擴(kuò)增soi，從而提供第一寡核苷酸克隆簇，各個(gè)寡核苷酸包括soi的拷貝。(iii)通過(guò)進(jìn)一步添加soi的一個(gè)或以上的拷貝以延伸第一簇中的單鏈多核苷酸，從而提供束縛多核苷酸的簇，其中所述簇中的多核苷酸包括目標(biāo)核苷酸序列的多個(gè)拷貝；以及(iv)至少部分地對(duì)所述簇中的多核苷酸進(jìn)行測(cè)序，以確定soi的核苷酸序列。

5、束縛soi可以是通過(guò)前期工作流程步驟獲得的多核苷酸的互補(bǔ)拷貝。

6、如本文所提及的“目標(biāo)序列”或soi可以是用戶試圖克隆擴(kuò)增的任何核苷酸序列。如本文所提及的soi的核苷酸序列是在初始克隆擴(kuò)增以提供第一克隆簇之前通過(guò)其5'端束縛的多核苷酸的序列。該序列可以是在工作流程的前期階段中由本文進(jìn)一步描述的束縛過(guò)程所產(chǎn)生的多核苷酸的互補(bǔ)拷貝。

7、通常，soi是用戶要尋求信息的多核苷酸序列。所述信息可以是序列信息，例如包括多核苷酸的序列或部分序列、或者是否存在特定的序列或多態(tài)性?；蛘?，所述信息可以是例如序列對(duì)于特定的結(jié)合伙伴的結(jié)合能力等結(jié)合信息，所述結(jié)合伙伴例如為引物或其他多核苷酸、核苷酸結(jié)合蛋白或藥物。

8、soi可為任意長(zhǎng)度，根據(jù)工作流程的參數(shù)和所需信息的要求而定。通常，soi的長(zhǎng)度為1個(gè)堿基至100,000個(gè)堿基。例如，它可以為1至10,000個(gè)堿基，優(yōu)選為5至1000個(gè)堿基，但是通常為約10至500個(gè)堿基或50至250個(gè)堿基。

9、在一些情況下，soi可以是已知序列的多核苷酸，也可以是未知序列或部分未知序列的多核苷酸。soi可以是dna或rna。例如，它可以是(但不限于)待測(cè)序的基因組dna片段，也可以是涵蓋多態(tài)性區(qū)域的多核苷酸、由rna序列(例如mrna、rrna或trna)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cdna、或者其序列可診斷或指示特定疾病、病癥或生物體(例如傳染性病原體)的多核苷酸片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，針對(duì)正向鏈要獲得的序列信息可以從互補(bǔ)(反向)鏈的序列獲得。

10、在一些實(shí)施方案中，多核苷酸或soi配備有銜接子。銜接子可以是添加到目標(biāo)序列的3'或5'末端(但優(yōu)選為同時(shí)添加到這兩端)的單鏈或雙鏈核苷酸序列。銜接子通常具有已知的序列，并且被設(shè)計(jì)為包括為了某些下游目的而配置的單獨(dú)或重疊的功能序列。這類(lèi)序列可以與引物(例如測(cè)序引物或克隆擴(kuò)增引物)雜交以捕獲寡核苷酸，或者與例如分子倒置探針等的互補(bǔ)序列雜交，或者它們可以被配置成便于與珠子或其他表面偶聯(lián)。另外的功能序列包括識(shí)別標(biāo)簽，例如核酸條形碼。在單獨(dú)的功能序列的情況下，該序列中沒(méi)有任何核苷酸構(gòu)成另一個(gè)功能序列的一部分。在重疊的功能序列的情況下，一個(gè)序列中的核苷酸也可以為第二功能序列的一部分，例如第一功能序列中的n個(gè)5′核苷酸可能形成第二功能序列中的n個(gè)3'核苷酸。通用銜接子是群體中所有的多核苷酸都攜帶的銜接子。

11、銜接子可作為上游工作流程的一部分(即前期步驟)而提供，或者為了克隆擴(kuò)增而單獨(dú)提供。工作流程可包括(在非限制性實(shí)例中)一個(gè)或以上的步驟，例如較大的多核苷酸(例如基因組dna)的分離和片段化、片段的擴(kuò)增(例如通過(guò)pcr或等溫?cái)U(kuò)增方法)、將銜接子添加到片段的5'端和/或3'端等。在一些實(shí)施方案中，可將銜接子連接到雙鏈片段的5'端和/或3′端，然后變性以提供單鏈多核苷酸。或者，可以通過(guò)轉(zhuǎn)座酶切割連接反應(yīng)(tagmentation?reaction)摻入銜接子，在該反應(yīng)中轉(zhuǎn)座酶(例如tn5)既切割dna，又附接上可包括銜接子序列的短標(biāo)簽。在其他方法中，可以在使用加尾引物擴(kuò)增或復(fù)制片段的步驟中摻入銜接子。

12、通常，所述表面是束縛所述多核苷酸的基材的表面。在非限制性實(shí)例中，基材可為isfet、玻璃或二氧化硅基材、不溶性顆?；?例如微球或納米球)、或者適于使束縛多核苷酸與液體試劑接觸的微流體裝置的一部分。表面可為平面(例如載玻片或半導(dǎo)體芯片的表面)，也可以是孔或其他3d特征的形式。表面/基材可包括各種材料，包括無(wú)機(jī)材料(例如玻璃、二氧化硅或ta2o5)或有機(jī)材料(包括各種聚合物)。

13、在一個(gè)實(shí)施方案中，表面為半導(dǎo)體芯片的表面，該芯片包括用于感測(cè)化學(xué)和/或生物反應(yīng)(包括測(cè)序反應(yīng))的場(chǎng)效應(yīng)晶體管(fet)陣列。這類(lèi)裝置是本領(lǐng)域所公知的(例如us7,686,929?b2、us?8,685,228b2、us?8,986,525?b2、us2010/0137143?a1)。優(yōu)選的實(shí)施方案包括半導(dǎo)體芯片，該芯片包括離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管(isfet)陣列，該陣列可用作各種反應(yīng)(包括核酸測(cè)序反應(yīng))的傳感裝置。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，芯片還包括位于isfet陣列上方并與其流體接觸的孔陣列。在這些實(shí)施方案中，通常在孔內(nèi)發(fā)生測(cè)序反應(yīng)，并且用isfet傳感器檢測(cè)離子的釋放。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，芯片包括安裝在芯片(有孔或無(wú)孔)頂部上的流動(dòng)池，用于將流體輸送到芯片/isfet陣列以及從中去除流體。術(shù)語(yǔ)“表面”還包括經(jīng)過(guò)改性的表面，以提供多核苷酸可與之偶聯(lián)的官能團(tuán)，所述改性包括但不限于通過(guò)直接將表面官能化的方式或者通過(guò)用帶有適當(dāng)官能團(tuán)的聚合物涂覆表面的方式將表面改性。

14、可采用多種方法將多核苷酸束縛于表面，例如，可將多核苷酸化學(xué)結(jié)合(例如通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合)至表面，或者可以由自身已結(jié)合至表面的捕獲部分將其捕獲。

15、在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)親和標(biāo)記物(例如蛋白質(zhì)或肽與其同源配體之間的相互作用)進(jìn)行束縛。通常，配體附連至多核苷酸，而蛋白質(zhì)或肽附連于表面作為捕獲部分。這樣的成對(duì)物質(zhì)包括例如生物素和生物素結(jié)合伙伴(例如親和素、neutravidintm(thermofisher)或鏈霉親和素)，還已知很多其他的成對(duì)物質(zhì)并且已得到充分研究且為市售可得的。生物素特別有用，因?yàn)楹怂岬纳锼鼗潜娝苤?，并且生物素與其結(jié)合伙伴之間的相互作用很強(qiáng)。此外，例如，生物素標(biāo)記的寡核苷酸可從多種來(lái)源獲得。在一些情況下，可以對(duì)表面進(jìn)行涂覆，以提供適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)使得多核苷酸或捕獲部分(例如捕獲寡核苷酸)可與之偶聯(lián)。

16、多核苷酸或寡核苷酸可通過(guò)5'或3'末端進(jìn)行束縛?？赏ㄟ^(guò)官能化的5'或3'核苷酸進(jìn)行束縛。在本發(fā)明中，通常多核苷酸和寡核苷酸通過(guò)各自的5'端束縛于表面。多核苷酸與表面附接的確切的化學(xué)作用取決于所涉及的表面，有許多化學(xué)物質(zhì)可商購(gòu)獲得以用于此目的，包括許多所謂的“點(diǎn)擊化學(xué)”方法(例如click?chemistry,a?powerfultool?forpharmaceutical?sciences(2008)hein,et?al.；pharm?res?25(10):2216-2230；以及ahitchhiker’s?guide?to?click-chemistry?with?nucleic?acids(2021)fantoniet?al.,chem?rev,121:7122-7154)。

17、在一些實(shí)施方案中，通過(guò)以下方式提供束縛多核苷酸：將多核苷酸與捕獲寡核苷酸雜交、以及延伸該捕獲寡核苷酸，以提供多核苷酸的互補(bǔ)拷貝，該互補(bǔ)拷貝通過(guò)其5'端束縛于表面。雜交可發(fā)生在捕獲寡核苷酸的3'部分和多核苷酸的3'部分的互補(bǔ)序列之間。多核苷酸的3′部分可包括銜接子，該銜接子包括與捕獲寡核苷酸的3′“捕獲”區(qū)互補(bǔ)的序列。

18、雜交后，捕獲寡核苷酸的3'端作為引物，并且利用聚合酶在捕獲的多核苷酸上方延伸，以提供雙鏈多核苷酸。然后使兩條鏈變性，留下一條通過(guò)其5'端束縛于表面的單鏈多核苷酸。該束縛多核苷酸包括原始捕獲的多核苷酸的互補(bǔ)拷貝(包括任何5'銜接子和3'銜接子)，它現(xiàn)在與捕獲寡核苷酸是連續(xù)一體的，因此通過(guò)其5'端束縛于表面。

19、在一些實(shí)施方案中，表面設(shè)置有具有相同的3'捕獲序列的捕獲寡核苷酸的單一群。在其他實(shí)施方案中，表面可設(shè)置有各自包括不同的3′捕獲序列的2種、3種、4種或以上的捕獲寡核苷酸的混合群。例如，表面可設(shè)置有兩種捕獲寡核苷酸混合的群，第一群包括與3'銜接子(反向引物)互補(bǔ)的3'序列，第二種包括與延伸的互補(bǔ)多核苷酸的3'端互補(bǔ)的3'序列并且作為正向引物，如本文進(jìn)一步描述。

20、捕獲寡核苷酸可包括提供附加功能(除3'捕獲部分之外)的核苷酸序列或其他特征，例如用于使束縛部分遠(yuǎn)離表面效應(yīng)等的間隔序列或化學(xué)間隔物，以及3'端的化學(xué)修飾核苷酸或鍵(例如硫代磷酸酯鍵)，以保護(hù)寡核苷酸免受聚合酶的3'至5′核酸外切酶活性的影響。

21、在一些實(shí)施方案中，單鏈多核苷酸可以在5'至3'方向上包括：5'側(cè)翼區(qū)、包括目標(biāo)核苷酸序列或由目標(biāo)核苷酸序列組成的核苷酸序列、以及3'側(cè)翼區(qū)。5'側(cè)翼區(qū)和3'側(cè)翼區(qū)直接偶聯(lián)至目標(biāo)序列的5'末端和3'末端，因此它們與目標(biāo)序列是連續(xù)一體的。通常，5'側(cè)翼區(qū)和3'側(cè)翼區(qū)為銜接子。

22、在優(yōu)選的布置方式中，5'側(cè)翼區(qū)和3'側(cè)翼區(qū)具有已知的預(yù)定的序列。通常它們是“通用銜接子”，即，它們是施加于表面的所有寡核苷酸所共有的銜接子。5'側(cè)翼區(qū)或銜接子和3'側(cè)翼區(qū)或銜接子通常具有不同的序列。各個(gè)側(cè)翼區(qū)可包括一個(gè)或以上的與適合各種功能的引物互補(bǔ)的序列。例如，各側(cè)翼區(qū)或銜接子可包括一個(gè)或以上的與克隆擴(kuò)增引物互補(bǔ)的區(qū)域，和/或3'側(cè)翼區(qū)可包括與測(cè)序引物互補(bǔ)的區(qū)域。如下文進(jìn)一步所述，它們可包括與分子倒置探針(mip)的3′和/或5'互補(bǔ)區(qū)互補(bǔ)的不同的通用區(qū)。在一些情況中，它們可以是與其他結(jié)合區(qū)分開(kāi)的，從而能夠獨(dú)立設(shè)計(jì)針對(duì)mip互補(bǔ)區(qū)的高特異性結(jié)合區(qū)。

23、對(duì)于3'側(cè)翼區(qū)而言，將該側(cè)翼區(qū)直接偶聯(lián)至目標(biāo)序列的3'端是有利的，這樣該側(cè)翼區(qū)的5'最末位核苷酸直接與目標(biāo)序列的3'最末位核苷酸結(jié)合。在測(cè)序引物與銜接子序列互補(bǔ)并且其3'端與銜接子的5'端共末端時(shí)，該測(cè)序引物能夠在目標(biāo)序列的3'最末端處啟動(dòng)測(cè)序。或者，在測(cè)序引物的3'端和目標(biāo)序列的5'端之間的側(cè)翼區(qū)中存在短的已知核苷酸序列時(shí)，可允許內(nèi)部序列調(diào)用控制。例如，可采用具有1、2、3、4或5個(gè)核苷酸的短序列。側(cè)翼區(qū)或銜接子內(nèi)的其他功能序列包括條形碼或其他識(shí)別序列。

24、在一些實(shí)施方案中，3'側(cè)翼區(qū)的3'端位于束縛多核苷酸的3'端。在一些實(shí)施方案中，3′側(cè)翼區(qū)的3'端位于束縛多核苷酸的3'端并且與其共末端。

25、在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)序列的3'端位于束縛多核苷酸的3'端。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)序列的3'端位于束縛多核苷酸的3'端并與其共末端。例如，在目標(biāo)序列沒(méi)有3'側(cè)翼區(qū)時(shí)可能就會(huì)如此。

26、在一些實(shí)施方案中，可將單一種類(lèi)的多核苷酸點(diǎn)在表面的不同區(qū)域上。在其他方法中，可以通過(guò)用多核苷酸群(其可包括不同的目標(biāo)序列)的稀溶液淹沒(méi)表面，由此將多核苷酸施加于表面。計(jì)算多核苷酸的稀釋度，使得單個(gè)多核苷酸以空間上分開(kāi)的方式被捕獲，從而使得克隆擴(kuò)增可提供分開(kāi)的簇。在一些實(shí)施方案中，表面包括例如旨在(統(tǒng)計(jì)學(xué)上)捕獲單個(gè)多核苷酸的孔等特征。

27、一旦將多核苷酸束縛于表面，就可以對(duì)該多核苷酸進(jìn)行克隆擴(kuò)增，以提供第一克隆簇，該克隆簇包括多條通過(guò)各自的5'端束縛于表面并且包括目標(biāo)核苷酸序列的單鏈多核苷酸。第一次克隆擴(kuò)增可以采用本領(lǐng)域公知的多種方法來(lái)實(shí)施，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。下面描述了其中一些非限制性的選擇。這些方法包括(但不限于)橋式擴(kuò)增(參見(jiàn)us9593328)、滾環(huán)擴(kuò)增、動(dòng)力學(xué)排除擴(kuò)增-examp(參見(jiàn)us9169513)、乳液pcr(特別適合與微球一起使用，參見(jiàn)us20100261230a1)和模板步移法(例如us2012/0156728)。通過(guò)重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)進(jìn)行克隆擴(kuò)增的方法也已被報(bào)道并在共同待決的申請(qǐng)gb2110479.9中進(jìn)行了論述。任何克隆擴(kuò)增方法都是適用的，只要它能提供包括多條通過(guò)各自的5'端束縛于表面的優(yōu)選為單鏈多核苷酸的克隆簇即可。在一些實(shí)施方案中，所選的克隆擴(kuò)增方法在所述第一簇中僅提供soi的正義拷貝或soi的反義拷貝，而不是同時(shí)提供這兩者。在一些實(shí)施方案中，所述方法在相同的第一簇中同時(shí)提供soi的正義拷貝和反義拷貝。在一些實(shí)施方案中，所述第一簇中的多核苷酸僅包括單個(gè)soi拷貝。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選地，束縛多核苷酸包括自由的3'端。在一個(gè)實(shí)施方案中，克隆擴(kuò)增方法提供了這樣的克隆簇：該克隆簇包括多條通過(guò)各自的5'端束縛于表面并且具有自由的3'端的多核苷酸，優(yōu)選地，僅包括一個(gè)soi拷貝。

28、在橋式擴(kuò)增的一種方法中，所述片段配備有5'銜接子和3'銜接子。同時(shí)包括正向引物和反向引物的混合群被束縛于表面。單鏈模板通過(guò)其3'銜接子與表面上的反向引物結(jié)合，并且聚合酶使得引物在模板上方延伸，從而產(chǎn)生帶有該3'銜接子和5'銜接子的模板的束縛互補(bǔ)拷貝。然后使該雙鏈體變性(通常通過(guò)將雙鏈體暴露于變性溶液中或加熱至雙鏈體的tm以上)以釋放原始模板。然后，束縛互補(bǔ)拷貝的5'銜接子被束縛正向引物捕獲，形成與表面結(jié)合的橋梁。使用束縛橋接互補(bǔ)鏈進(jìn)行的正向引物的延伸提供了通過(guò)第二捕獲寡核苷酸偶聯(lián)到表面的原始單鏈片段的拷貝。然后使雙鏈橋變性，留下正向鏈的拷貝和反向鏈的拷貝通過(guò)各自的5'端束縛于表面。清洗后，這些鏈的3′端被束縛的正向引物和反向引物捕獲，然后進(jìn)行進(jìn)一步的延伸-變性循環(huán)，使克隆簇?cái)U(kuò)散到整個(gè)表面，直到克隆擴(kuò)增完成(例如，參見(jiàn)us10370652b2和us7972820b2)。

29、通過(guò)重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)進(jìn)行克隆擴(kuò)增的方法利用了兩種引物，其中一者(反向引物)是束縛在表面上的捕獲寡核苷酸，而另一者(正向引物)位于溶液中。多核苷酸片段配備有5'銜接子和3′銜接子。3′銜接子與捕獲寡核苷酸雜交，然后利用聚合酶使捕獲寡核苷酸的3'端在多核苷酸模板上方延伸，以提供多核苷酸的互補(bǔ)拷貝，該互補(bǔ)拷貝通過(guò)其5'端束縛于表面但是其3'端是自由的。然后提供包括重組酶、單鏈dna結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶的反應(yīng)混合物，該重組酶和單鏈dna結(jié)合蛋白的協(xié)同作用使得雙鏈體的3'端分開(kāi)。這使得正向(溶液相)引物可與束縛互補(bǔ)鏈的3'端接觸，并且使得鏈置換聚合酶可將正向引物延伸，最終將原始片段置換到溶液中。在一些系統(tǒng)中(例如t4)，可以提供重組介導(dǎo)蛋白介導(dǎo)聚合酶與單鏈dna的接觸。然后，釋放的片段自由地與另一個(gè)捕獲寡核苷酸雜交，以重復(fù)該過(guò)程。通過(guò)提高反應(yīng)混合物的粘度，可以減少所釋放模板的局部擴(kuò)散，從而能夠減少簇?cái)U(kuò)散。結(jié)合圖1進(jìn)一步論述了這種方法。

30、在模板步移法(us2012/0156728)中，捕獲寡核苷酸具有低tm(在其反應(yīng)條件下)的3'端，例如，它可以是具有高比例的a或t(或u)的部分。例如，它可以是具有20t的序列。soi配備有銜接子，并且3'銜接子包括與捕獲寡核苷酸的3'區(qū)互補(bǔ)的區(qū)域(例如20a或30a)，soi的其余部分具有比銜接子的3'端更高的tm。使具有5'銜接子和3'銜接子的多核苷酸與捕獲寡核苷酸的低tm端雜交，并使用多核苷酸作為模板延伸捕獲寡核苷酸的3'端，以提供通過(guò)其5'端束縛于表面的互補(bǔ)拷貝。雙鏈體包括tm相對(duì)較高的區(qū)域和位于捕獲寡核苷酸周?chē)牡蛅m區(qū)域。然后升高溫度，使原始多核苷酸的3'端與捕獲寡核苷酸脫雜交，但不要使整個(gè)雙鏈體在soi上解離。隨著溫度降低，低tm區(qū)域可以重新與相鄰的捕獲寡核苷酸雜交，從而提供模板，以再次由該模板延伸捕獲寡核苷酸，由此從原始延伸的捕獲寡核苷酸上置換出原始多核苷酸。

31、動(dòng)力學(xué)排除擴(kuò)增法(examp)是為了解決克隆污染問(wèn)題(特別是孔狀特征中的克隆污染問(wèn)題)而開(kāi)發(fā)的，其中，在孔狀特征的情況下，工作流程力圖在各個(gè)孔的表面上捕獲和擴(kuò)增單個(gè)多核苷酸片段，并且捕獲和擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行。如果捕獲速度快、但擴(kuò)增速度慢，則很有可能在附近捕獲具有不同序列的第二多核苷酸片段，從而導(dǎo)致由這兩個(gè)不同的序列生成的簇發(fā)生重疊并且使克隆性降低。動(dòng)力學(xué)排除擴(kuò)增法試圖通過(guò)使克隆擴(kuò)增的速度超過(guò)捕獲新的多核苷酸種類(lèi)的速度來(lái)保持克隆性。這要減少局部區(qū)域的捕獲寡核苷酸的供應(yīng)，并且阻礙新的多核苷酸種類(lèi)接觸捕獲寡核苷酸的領(lǐng)地。

32、實(shí)現(xiàn)此目的的一種方法是與dna聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白(ssbp)和重組酶一起提供寡核苷酸片段(雙鏈形式)?？刂贫嗪塑账嵩谌芤褐械臐舛?，使得捕獲寡核苷酸對(duì)單鏈多核苷酸的捕獲速度遠(yuǎn)低于克隆擴(kuò)增的速度，從而使附近的捕獲寡核苷酸耗盡。

33、克隆擴(kuò)增方法可提供僅僅單一鏈的簇(例如rpa)，或者提供同時(shí)具有正向鏈和反向鏈的簇(例如橋式擴(kuò)增)。優(yōu)選的是，所選的ca方法產(chǎn)生包括目標(biāo)序列并且具有自由的3'末端的線性多核苷酸的簇。在一個(gè)實(shí)施方案中，線性多核苷酸包括單個(gè)soi拷貝并且具有自由的3'末端。通過(guò)rpa進(jìn)行克隆擴(kuò)增通常是本發(fā)明中使用的優(yōu)選方法。

34、一旦第一次克隆擴(kuò)增完成，表面就會(huì)包括在該表面上排列為二維特征(或“草坪樣”)的多核苷酸簇，各個(gè)多核苷酸都包括目標(biāo)序列。通常，此時(shí)各個(gè)多核苷酸僅包括一個(gè)soi拷貝。但是，通過(guò)延伸第一簇中的至少一部分束縛單鏈多核苷酸(通過(guò)進(jìn)一步添加soi的一個(gè)或以上的拷貝)，可以提供包括(或至少其中一部分包括)原始目標(biāo)核苷酸序列的多個(gè)拷貝的束縛多核苷酸的簇。通過(guò)這種方式，所述簇中的目標(biāo)序列的拷貝數(shù)可以增加若干倍，而無(wú)需將更多的寡核苷酸拷貝束縛于表面，但克隆性得以保持。這種方法解決了以不容易導(dǎo)致簇?cái)U(kuò)散的方式提高單位面積soi數(shù)量的問(wèn)題。這樣易于通過(guò)提供有效的三維簇改善信號(hào)，該三維簇具有多個(gè)soi拷貝，并且還可以提供測(cè)序銜接子的多個(gè)拷貝以及在soi下游處理中有用的其他功能序列的多個(gè)拷貝。

35、在一個(gè)便利的實(shí)施方案中，第一簇中的束縛單鏈多核苷酸可以通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增(rca)(至少soi)進(jìn)行延伸。rca可用于僅復(fù)制目標(biāo)序列(或其至少一部分)，或者還可以額外地復(fù)制全部或部分5'銜接子和/或3'銜接子。以此方式，當(dāng)原始多核苷酸中存在有被布置成自各個(gè)soi啟動(dòng)測(cè)序的測(cè)序銜接子時(shí)，該方法提供所述測(cè)序銜接子的拷貝；同樣，當(dāng)原始多核苷酸中存在有任何在soi的下游處理中有用的其他功能序列時(shí)，該方法提供所述其他功能序列的拷貝。

36、通過(guò)rca進(jìn)行延伸可以以多種方式實(shí)現(xiàn)，并且無(wú)論soi具有已知或部分已知的序列還是未知的序列都可以應(yīng)用，這使其成為增加克隆簇中的soi密度的有效方法，能夠適應(yīng)各種工作流程。

37、在一個(gè)實(shí)施方案中，滾環(huán)擴(kuò)增可通過(guò)包括以下步驟的方法實(shí)施：(a)提供單鏈環(huán)狀核苷酸探針，其包括與第一克隆簇中的soi(以及可選地，5'銜接子和/或3'銜接子或其部分)互補(bǔ)的核苷酸序列；以及(b)使用環(huán)狀核苷酸探針作為模板，延伸束縛單鏈多核苷酸的3'端，優(yōu)選使用鏈置換聚合酶進(jìn)行延伸，從而通過(guò)進(jìn)一步添加目標(biāo)序列的一個(gè)或以上的拷貝，延伸束縛單鏈多核苷酸(或其中至少一部分)的3′端。

38、在一些實(shí)施方案中，可以提供單鏈環(huán)狀探針作為預(yù)制的包括目標(biāo)序列的互補(bǔ)拷貝的環(huán)狀探針。然后將soi的互補(bǔ)拷貝與束縛soi(以及可選地，任何5'銜接子或3'銜接子或其部分)雜交，然后通過(guò)使用鏈置換聚合酶互補(bǔ)地重復(fù)復(fù)制環(huán)狀探針以延伸束縛寡核苷酸的3'端。當(dāng)soi具有已知的序列時(shí)，這種方法特別有用。有利的是，可以在溶液中制備環(huán)狀探針，例如通過(guò)使包括soi的互補(bǔ)拷貝的線性探針的自由端相連制備環(huán)狀探針。

39、在該方法的進(jìn)一步改進(jìn)方式中，單鏈環(huán)狀核苷酸探針包括與soi互補(bǔ)的核苷酸序列、以及位于soi側(cè)翼的5'銜接子和/或3'銜接子(其序列不在束縛多核苷酸中)的互補(bǔ)拷貝。然后，束縛多核苷酸的rca使得功能性銜接子摻入延伸鏈中。

40、在任一情況下，環(huán)狀探針還可以包括可選的接頭區(qū)，該接頭區(qū)從與soi的互補(bǔ)序列的3'端(以及可選地，3'銜接子)延伸至soi的5′端(以及可選地，任何5'銜接子)。這類(lèi)單鏈環(huán)狀探針可以通過(guò)多種方式構(gòu)建，這些方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且在本文其他地方進(jìn)行了論述。

41、在一些實(shí)施方案中，環(huán)狀探針不是作為預(yù)制的環(huán)狀探針、而是作為線性探針提供的，由該線性探針可原位(即，在表面上)合成環(huán)狀探針，而非預(yù)制的探針。實(shí)際上，這意味著在形成環(huán)狀探針的同時(shí)，線性探針的至少一部分與多核苷酸雜交，優(yōu)選地，在探針與多核苷酸雜交的同時(shí)發(fā)生環(huán)化過(guò)程。

42、在一種方法中，環(huán)狀探針的原位形成可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)：

43、(a)提供線性單鏈核苷酸探針，其在5'至3'方向上包括：5'互補(bǔ)區(qū)(5'cr)、可選的接頭區(qū)、以及3'互補(bǔ)區(qū)(3'cr)；其中5'cr和3′cr被配置為與束縛單鏈多核苷酸上各自獨(dú)立的序列(雜交位點(diǎn))雜交；

44、(b)使探針的5′cr朝著探針的3'cr的方向與束縛單鏈多核苷酸雜交；其中5'cr所雜交的序列位于3'cr所雜交的序列的上游(即，更靠近束縛多核苷酸的5'端)；

45、(c)可選地，使用單鏈多核苷酸的序列作為模板延伸線性探針的3′端；以及

46、(d)通過(guò)將探針的可選地經(jīng)過(guò)延伸的3'端連接到探針的5′端，使探針環(huán)化。這類(lèi)線性探針可稱(chēng)為“分子倒置探針”。

47、選擇探針的5'cr的序列和探針的3'cr的序列，使得在可選的延伸和連接之后，生成包括目標(biāo)序列的互補(bǔ)拷貝的單鏈環(huán)狀探針。5'cr和3'cr的序列可以從多種排列方式中選擇。

48、在非限制性實(shí)例中，5′cr可以僅與5'銜接子雜交，或者與5'銜接子和soi的5'最末部分雜交，或者僅與soi的5'最末部分雜交。同樣，3'cr可以僅與3'銜接子雜交，或者與3'銜接子和soi的3'最末部分雜交，或者僅與soi的3'最末部分雜交。

49、5′cr可以與完全位于soi上游(即，比soi更靠近束縛多核苷酸的5'端)的序列雜交(例如，使得5′cr的5'最末位核苷酸與位于soi的5'最末端上游的核苷酸互補(bǔ))，或者5'cr可以與位置和soi的5′端有重疊的序列雜交(例如，使得該5'最末位核苷酸與soi內(nèi)的核苷酸互補(bǔ))，或者5'cr可以與完全位于soi內(nèi)的序列雜交(例如，使得5'cr的3'最末位核苷酸可以與soi的5'最末位核苷酸雜交，或者與更靠近3'處的核苷酸雜交)。

50、同樣，3′cr可以與完全位于soi下游(即，比soi更靠近束縛多核苷酸的3'端)的序列雜交(例如，使得3'cr的3'最末位核苷酸與位于目標(biāo)序列的3'最末端上游的核苷酸互補(bǔ))，或者3'cr可以與位置和soi的3'端有重疊的序列雜交(例如，使得該3'最末位核苷酸與soi內(nèi)的核苷酸互補(bǔ))，或者3'cr可以與完全位于soi內(nèi)的序列雜交(例如，3′cr的5'最末位核苷酸可以與soi的3'最末位核苷酸雜交)。

51、在一些情況下，3′cr可能在5'cr與其靶標(biāo)雜交之前發(fā)生雜交和延伸。在這些情況下，延伸的3'cr可能會(huì)阻礙5'cr的雜交，并且使擴(kuò)增失敗，這會(huì)導(dǎo)致延伸的多核苷酸的產(chǎn)率較低以及測(cè)序反應(yīng)中的信號(hào)較弱。為了防止發(fā)生這種情況，可以在3'cr雜交之前，使5'cr與束縛多核苷酸雜交。這確保了在探針的5'端雜交之前，探針的3'端不能延伸(參見(jiàn)圖4a)。在一種方法中，選擇5'cr和3'cr的序列，使得5'cr的tm高于3'cr的tm。然后，包括適當(dāng)?shù)臏囟确植嫉姆桨笇?huì)確保3'延伸和連接按要求進(jìn)行。對(duì)于一些核苷酸序列而言，有可能選擇出具有適當(dāng)tm的序列，mip的5'cr和3'cr將會(huì)以上述方式與該序列雜交。在其他情況下，可能需要提供包括具有適當(dāng)tm的序列的5'銜接子和3'銜接子?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方法在任何制備方案或工作流程中的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)將這類(lèi)銜接子添加到多核苷酸或目標(biāo)序列上。

52、當(dāng)采用適當(dāng)?shù)臏囟确植紩r(shí)，5'cr和3'cr的tm之間應(yīng)該有足夠的差異，以確保5'cr在3'cr之前雜交。該分布要考慮生產(chǎn)速度、產(chǎn)率和不期望的副產(chǎn)物。通常，二者的tm差值應(yīng)在2℃和20℃之間，例如至少2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃或以上，但是已發(fā)現(xiàn)，差值為大約10℃時(shí)可以產(chǎn)生良好的結(jié)果。

53、因此，在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的分子倒置探針，以用于制備束縛多核苷酸的克隆簇，例如，如本文進(jìn)一步描述，該分子倒置探針在3'至5'方向上包括或由以下組成：(a)3'cr，(b)可選的接頭區(qū)，以及(c)5'cr，其中3'cr的序列被選擇為與束縛多核苷酸的第一部分雜交，而5'cr的序列被選擇為與束縛多核苷酸的第二部分雜交，第二部分與第一部分是各自獨(dú)立的；并且其中5′cr的tm高于3'cr的tm。該方法示于圖4b中。

54、如上文和本文其他地方進(jìn)一步詳述，通過(guò)目標(biāo)序列、目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列、或它們的一部分，使得束縛多核苷酸的第一部分與束縛多核苷酸的第二部分(即，供mip的cr雜交用的兩個(gè)雜交位點(diǎn))可以各自獨(dú)立，這取決于5'cr和3'cr所雜交的序列的選擇。

55、因此，上述用于原位形成環(huán)狀探針的方法中的步驟(b)可包括以下步驟：在高于3'cr的tm但等于或低于5'cr的tm的溫度下，使探針的5′cr與束縛單鏈多核苷酸雜交；然后在低于5′cr的tm、特別是在等于或低于3'cr的tm的溫度下，使探針的3'cr與多核苷酸雜交。

56、下面給出了用于這種方案中的示例性mip。下文進(jìn)一步描述的實(shí)施例6的情況中使用了這種mip，可以結(jié)合以下溫度分布使用該mip：95℃2分鐘、55℃10分鐘，以使5′cr雜交；隨后45℃30分鐘，以在延伸和連接之前使3'cr雜交。

57、/5phos/atgaagccaaggctggtgggtcgacagcagcttcaacattcgttagtcgaatcagtcctgtccgagaaaacgagacatgcc?seq?id?no:1

58、本發(fā)明的另一方面提供了一種制備束縛多核苷酸的克隆簇的方法，包括：(i)提供單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸通過(guò)其5'端束縛于表面；(ii)對(duì)單鏈多核苷酸進(jìn)行第一次克隆擴(kuò)增，以提供第一多核苷酸簇，所述簇中的多核苷酸通過(guò)各自的5'端束縛于表面；以及(iii)使用如本文所述的mip(特別是上文所述的改進(jìn)的mip)通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增延伸第一簇中的束縛單鏈多核苷酸。束縛多核苷酸可以是本文其他地方進(jìn)一步描述的任何多核苷酸。在一種方法中，滾環(huán)擴(kuò)增的方法可包括：(a)使第一簇中的多核苷酸與mip(例如上文所述的改進(jìn)的mip)接觸；(b)在高于3'cr的tm但等于或低于5'cr的tm的溫度下，使mip的5′cr與束縛單鏈多核苷酸雜交；隨后在等于或低于3'cr的tm的溫度下，使探針的3'cr與多核苷酸雜交；(c)可選地延伸mip的3'端；(c)通過(guò)將探針的可選地經(jīng)過(guò)延伸的3′端連接到探針的5'端，使探針環(huán)化；以及(d)使環(huán)化的探針與鏈置換聚合酶接觸，以延伸該單鏈多核苷酸。

59、如前文所述，無(wú)論soi具有已知的序列、部分已知的序列還是完全未知的序列，都可以應(yīng)用rca方法使序列延伸。當(dāng)5'cr和3'cr僅與soi的5′銜接子和3'銜接子內(nèi)的序列雜交時(shí)，可以擴(kuò)增未知的序列。在其他布置方式中，當(dāng)銜接子要至少部分地與soi雜交時(shí)，一般需要知道soi的序列或其至少一部分。

60、線性探針還可以包括接頭區(qū)。接頭區(qū)(如果存在)從5′cr的3′端延伸至3′cr的5'端。同樣，當(dāng)探針作為預(yù)制的環(huán)狀探針提供時(shí)，它也可以附加包括接頭區(qū)，該接頭區(qū)從與soi互補(bǔ)的序列的3'端延伸至與soi互補(bǔ)的序列的5'末端；或者當(dāng)探針包括與束縛多核苷酸中存在的任何側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)的區(qū)域時(shí)，該接頭區(qū)從3'側(cè)翼區(qū)的3'端延伸至5′側(cè)翼區(qū)的5'端(如果存在)。

61、在任一情況下，接頭可包括一個(gè)或以上的功能序列，隨著接頭的延伸，所述功能序列將會(huì)被互補(bǔ)地復(fù)制。這些功能序列可以包括(例如)與諸如測(cè)序引物或擴(kuò)增引物互補(bǔ)的序列，或者可包括與本文其他地方描述的另外的捕獲寡核苷酸互補(bǔ)的序列。

62、在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭包括在互補(bǔ)復(fù)制時(shí)與結(jié)合到表面的第二種捕獲寡核苷酸雜交的序列。在一些實(shí)施方案中，該序列與3'銜接子或5'銜接子的序列不同，并且使得在第二輪克隆擴(kuò)增中可任選地采用支化rca，如本文其他地方進(jìn)一步描述。

63、接頭區(qū)的長(zhǎng)度僅需要足以容納其中所需的任何功能序列并確保探針有效環(huán)化即可。因此，接頭可為任何適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度。例如，接頭的長(zhǎng)度可以為40nt至160nt，優(yōu)選為40nt至70nt。較短的接頭可確保獲得較小的環(huán)狀探針，從而減少空間位阻，同時(shí)進(jìn)行需要更少核苷酸的高效rca。

64、在一些實(shí)施方案中，一旦線性探針與束縛多核苷酸雜交，可通過(guò)一個(gè)或以上的核苷酸使得線性探針的3'末端與5′末端各自獨(dú)立。通常，通過(guò)soi的全部或一部分使得3'末端和5′末端各自獨(dú)立，這取決于5′cr和3'cr所雜交的序列的位置?？梢允褂镁酆厦?優(yōu)選缺乏5′至3'核酸外切酶活性的聚合酶)延伸探針的3'末端。示例性的聚合酶包括t4聚合酶或taq聚合酶。一旦3′末端經(jīng)過(guò)延伸，就可以使用連接酶(例如t4連接酶或taq連接酶)將延伸的3'末端連接到5'磷酸化末端，以使探針環(huán)化。在一些實(shí)施方案中，線性探針的5′cr和3′cr組合起來(lái)延伸覆蓋了整個(gè)soi，在這種情況下，不需要進(jìn)行延伸，而是簡(jiǎn)單地將3′末端和5′末端連接以使探針環(huán)化。

65、無(wú)論環(huán)狀探針是預(yù)制提供的還是原位形成的，一旦探針就位，就可以使用環(huán)狀探針作為模板延伸束縛多核苷酸的3'端。進(jìn)一步將soi的一個(gè)或以上的拷貝添加到束縛多核苷酸的3'端，提供了束縛多核苷酸的簇，其中所述簇中的多核苷酸(或其至少一部分)包括目標(biāo)核苷酸序列的多個(gè)拷貝。延伸第一簇中的束縛單鏈多核苷酸，提供了附加的soi拷貝，而不需要增加捕獲寡核苷酸的密度，也不會(huì)擴(kuò)大原始簇所占據(jù)的面積。

66、在一些實(shí)施方案中，例如當(dāng)環(huán)狀探針不是與soi的整個(gè)3'銜接子雜交時(shí)，可能存在短的單鏈3'懸垂，在這種情況下，可以使用3'-5′核酸外切酶將其去除，或者可以利用聚合酶(例如phi29聚合酶)的3′-5'核酸外切酶活性。

67、在一些情況下，在環(huán)化連接完成之前，束縛多核苷酸的3'端可能繞著探針延伸。如果發(fā)生這種情況，探針的5'端可能會(huì)從多核苷酸上脫離，并且可能不會(huì)發(fā)生環(huán)化連接。因此，在一些實(shí)施方案中，在完成填隙延伸和連接的同時(shí)，使多核苷酸的3′端的延伸受到阻止(或至少延遲)。在一些實(shí)施方案中，這是通過(guò)將單鏈環(huán)狀多核苷酸探針與束縛多核苷酸雜交而留下3'單鏈懸垂來(lái)實(shí)現(xiàn)的。有利的是，懸垂與探針不互補(bǔ)，從而阻止形成適合于通過(guò)聚合酶延伸的雙鏈特征。然后，可以在環(huán)狀探針復(fù)制之前通過(guò)核酸外切酶活性去除3'延伸端。

68、在另外的實(shí)施方案中，單鏈環(huán)狀多核苷酸探針與3'銜接子雜交，留下足以與保護(hù)性寡核苷酸雜交的3'懸垂，該保護(hù)性寡核苷酸的5'端與該懸垂的3'端共末端。寡核苷酸雙鏈體的tm低于探針的tm，從而阻止了鏈延伸，直到將溫度升高到高于寡核苷酸雙鏈體的tm使寡核苷酸去除為止。然后可以如前文所述去除該懸垂。

69、使用聚合酶，優(yōu)選使用鏈置換聚合酶，使束縛多核苷酸的3'端在探針周?chē)M(jìn)行延伸。這樣，隨著合成的進(jìn)行，探針持續(xù)地與延伸的擴(kuò)增子分離，并且合成soi的多個(gè)拷貝。在延伸的擴(kuò)增子中，soi拷貝與和環(huán)狀探針的其余部分互補(bǔ)的序列穿插分布。根據(jù)線性探針的5′cr和3'cr所雜交的序列，soi的側(cè)翼也可能為全長(zhǎng)或截短形式的銜接子。

70、如果cr摻入了銜接子中各種功能序列的互補(bǔ)拷貝，則功能序列將會(huì)在延伸的擴(kuò)增子中復(fù)制，并且功能序列將保持與soi相關(guān)聯(lián)。因此，在一些實(shí)施方案中，選擇探針的5′cr的序列和探針的3'cr的序列，使得在可選的延伸和連接之后，生成包括目標(biāo)序列的互補(bǔ)拷貝以及5'銜接子和/或3'銜接子的拷貝的單鏈環(huán)狀探針；或者使得任一銜接子足以包括一個(gè)或以上的功能序列，例如本文進(jìn)一步論述的任何功能序列。特別優(yōu)選的是，當(dāng)3'銜接子包括與測(cè)序引物互補(bǔ)的區(qū)域時(shí)，選擇3'cr的序列以保持測(cè)序引物和soi之間的功能關(guān)系，如本文進(jìn)一步所述。

71、mip雜交、環(huán)化和滾環(huán)擴(kuò)增的組合在本文中可稱(chēng)為線性簇串聯(lián)化(linear?clusterconcatemerization)或lcc。

72、在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種捕獲寡核苷酸可以作為與第一種捕獲寡核苷酸混合的群提供在表面上。第二捕獲寡核苷酸與環(huán)狀探針接頭區(qū)內(nèi)的序列的互補(bǔ)序列雜交，但是不與soi或其5'銜接子或3'銜接子雜交。隨著環(huán)狀探針被重復(fù)復(fù)制，它提供了與soi和銜接子的拷貝穿插分布的接頭的互補(bǔ)拷貝。所述接頭的互補(bǔ)拷貝暴露出可與第二種捕獲寡核苷酸雜交的多個(gè)序列，因此延伸鏈在多個(gè)位點(diǎn)被第二捕獲寡核苷酸捕獲。然后，捕獲寡核苷酸的3'端通過(guò)聚合酶的作用進(jìn)行延伸，形成soi的互補(bǔ)拷貝和接頭的正義拷貝。隨著新鏈的延伸，它會(huì)從第二捕獲寡核苷酸的下一個(gè)拷貝中置換出下一個(gè)雙鏈體，從而產(chǎn)生多個(gè)束縛多核苷酸，其包括多個(gè)與連接區(qū)域拷貝交替的soi互補(bǔ)拷貝。然后，可以使用與適當(dāng)?shù)你暯幼踊パa(bǔ)的測(cè)序引物對(duì)來(lái)自同一簇中的soi的正向鏈和反向鏈進(jìn)行測(cè)序。

73、一旦生成了延伸的克隆簇，它就可以用于各種下游過(guò)程，如本文進(jìn)一步描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)核苷酸測(cè)序方法確定3-d簇內(nèi)的soi的序列或部分序列。

74、序列測(cè)定可以通過(guò)任何適合于固定或束縛于表面的多核苷酸的方法進(jìn)行，特別是被稱(chēng)為“合成測(cè)序(sbs)”的方法。在這種方法中，在制備克隆簇之后，將測(cè)序引物退火到3'銜接子上，并檢測(cè)與soi互補(bǔ)地依次摻入延伸鏈中的核苷酸。在一些方法中，用熒光染料標(biāo)記核苷酸。該染料可作為鏈合成終止劑。在每次dntp摻入后，將染料成像以識(shí)別堿基，然后切除該染料以便摻入下一個(gè)核苷酸。在其他方法中，克隆擴(kuò)增的多核苷酸被束縛在半導(dǎo)體芯片(例如isfet)的表面上，通過(guò)檢測(cè)在dntp摻入序列的過(guò)程中所釋放的質(zhì)子(每摻入1個(gè)核苷酸釋放1個(gè)質(zhì)子)檢測(cè)soi中摻入的各個(gè)核苷酸。在這種情況下，dntp不需要用熒光標(biāo)記。

75、下一代測(cè)序法有多種變型，包括依賴(lài)于sbs的變型，但本文描述的克隆擴(kuò)增方法適合與任何可在固定化多核苷酸群上實(shí)施的測(cè)序法聯(lián)用。

76、在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種基材，該基材的表面偶聯(lián)有多條單鏈多核苷酸，這些單鏈多核苷酸排列成多個(gè)克隆簇，其中各個(gè)克隆簇內(nèi)的多核苷酸包括多個(gè)交替的第一核苷酸序列的拷貝和第二核苷酸序列的拷貝，其中第一核苷酸序列為各個(gè)簇中的單鏈多核苷酸所共有，而第一序列并非如此。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了如本文所述的單鏈多核苷酸的克隆簇，其中所述簇中的多核苷酸通過(guò)各自的5'端束縛于表面。

77、在一些實(shí)施方案中，第一序列(相當(dāng)于本文其他地方進(jìn)一步論述的目標(biāo)序列)可以在簇內(nèi)以正義形式或反義形式存在，但不是二者同時(shí)存在。在一些實(shí)施方案中，第一序列的正義形式和反義形式均存在于簇中。在這種情況下，各個(gè)簇中的多核苷酸包括第一序列的正義和反義拷貝以及第二序列的正義和反義拷貝，第二序列的正義和反義拷貝為各個(gè)簇中的單鏈核苷酸所共有，而第一序列的正義和反義拷貝并不是各個(gè)簇中的單鏈核苷酸所共有的。

78、通常，各個(gè)簇內(nèi)的多核苷酸包括第一序列(或其反義序列)的多個(gè)拷貝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，它們包括第一序列或其反義序列的至少2個(gè)拷貝、優(yōu)選至少3個(gè)拷貝、更優(yōu)選至少4個(gè)拷貝、甚至更優(yōu)選至少5個(gè)拷貝。同樣，各個(gè)簇內(nèi)的多核苷酸包括第二序列(或其反義序列)的多個(gè)拷貝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，它們包括第二序列或其反義序列的至少2個(gè)拷貝、優(yōu)選至少3個(gè)拷貝、更優(yōu)選至少4個(gè)拷貝、甚至更優(yōu)選至少5個(gè)拷貝。

79、通常，各個(gè)簇內(nèi)的多核苷酸都具有自由的3'端。通常，由于表面最初包括1種、2種、3種、4種、5種或以上的捕獲寡核苷酸，因此在一些情況下，那些不包括簇狀多核苷酸的區(qū)域?qū)?huì)包括未使用的捕獲寡核苷酸，因此可能還包括1種、2種、3種、4種、5種或以上的通常保持未與多核苷酸雜交的捕獲寡核苷酸。然而，簇內(nèi)通常很少有未使用的捕獲寡核苷酸，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诘谝惠喛寺U(kuò)增期間就逐漸在局部耗盡了。在一些實(shí)施方案中，表面包括單一種類(lèi)的捕獲寡核苷酸，在一些實(shí)施方案中，表面包括兩種捕獲寡核苷酸。

80、包括相同第一序列的簇的數(shù)量取決于所存在的soi種類(lèi)數(shù)。因此，例如如果僅存在2種soi，則50％的簇將包括相同的第一序列。

81、在本文中，自由的3'端是指末端3'核苷酸具有能夠通過(guò)聚合酶(例如鏈置換聚合酶)的作用進(jìn)行延伸的自由的3'-oh基團(tuán)。它不是發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)的一部分。

82、在本文中，克隆擴(kuò)增是單個(gè)多核苷酸的增殖，以提供多個(gè)具有相同序列的拷貝(克隆)。單個(gè)多核苷酸及其克隆通常通過(guò)各自的5′末端核苷酸或3'末端核苷酸(優(yōu)選通過(guò)5'末端核苷酸)束縛于基材表面。克隆簇是在表面離散區(qū)域中群聚(特別是以緊密堆積的方式群聚)在一起的多個(gè)多核苷酸克隆。克隆簇通常由單個(gè)起始束縛多核苷酸的克隆擴(kuò)增獲得，但可供選擇的是，它們也可以通過(guò)將包括單一種類(lèi)多核苷酸的組合物點(diǎn)到表面上而獲得。在一些實(shí)施方案中，可能有意地使克隆簇包括不止一種多核苷酸。例如，它們可能包括單鏈多核苷酸的拷貝以及該單鏈多核苷酸的互補(bǔ)拷貝?？寺〈嘏c其他克隆簇之間可能重疊，但優(yōu)選為不重疊。

83、在本文中，如果一條鏈中的各個(gè)核苷酸與另一條鏈中的核苷酸經(jīng)歷了序列的沃森-克里克(watson?crick)堿基配對(duì)，則認(rèn)為兩個(gè)序列是互補(bǔ)的。這兩條鏈互為彼此的互補(bǔ)拷貝。

84、在本文中，當(dāng)說(shuō)到兩個(gè)序列相互雜交時(shí)，它們是在所討論的過(guò)程的條件下進(jìn)行的，因此當(dāng)說(shuō)到引物與核苷酸序列雜交時(shí)，它是在引物延伸、測(cè)序等的條件(例如離子強(qiáng)度、ph、溫度)下進(jìn)行的。

85、在本文中，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指通過(guò)共價(jià)鍵(通常是磷酸二酯鍵)連接的兩個(gè)或以上核苷酸的聚合物。在一些情況下，多核苷酸可能包括“非天然”鍵如硫代磷酸酯鍵，例如在其有利于降低或防止核酸外切酶活性時(shí)即可如此。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸片段”、“寡核苷酸(oligonucleotide或oligo)”與多核苷酸具有相同的含義，并且這些術(shù)語(yǔ)可以互換使用。多核苷酸可以為單鏈或雙鏈，并且可以是dna、rna或dna/rna雜合雙鏈體。

86、在本文中，術(shù)語(yǔ)“束縛”是指所提及的多核苷酸通過(guò)化學(xué)鍵(優(yōu)選為共價(jià)鍵)結(jié)合到表面或結(jié)合到該表面被覆的任何涂層上。