本發(fā)明屬于胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及囊胚培養(yǎng)液，具體涉及一種改良型囊胚培養(yǎng)液及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、體外受精-胚胎移植(in?vitro?fertilization-embryo?transfer，ivf-et)技術(shù)的出現(xiàn)為不孕不育夫婦提供了擁有健康孩子的機(jī)會。但數(shù)據(jù)表明，一些夫婦的胚胎在體外培養(yǎng)移植后會出現(xiàn)反復(fù)妊娠丟失的現(xiàn)象，其發(fā)生率約為2％～5％且近年來有上升的趨勢。反復(fù)妊娠丟失常見的原因有胚胎發(fā)育異常、母體解剖異常、母體內(nèi)分泌異常、母體代謝異常等，且仍有40％～60％無法找到明確的致病因素。胚胎發(fā)育異常的常見原因之一是胚胎質(zhì)量低。其中，和年輕夫婦相比較，高齡夫婦獲得低質(zhì)量的胚胎的概率更高，并且低質(zhì)量的胚胎會導(dǎo)致其后續(xù)發(fā)育異常從而進(jìn)一步導(dǎo)致反復(fù)妊娠丟失。

2、研究表明，人類母體生殖道可以分泌生長因子，生長因子存在于輸卵管液和子宮液中，胚胎可以表達(dá)其受體。因此在體內(nèi)，胚胎的發(fā)育會受到母體生殖道分泌的生長因子的調(diào)節(jié)。此外，許多生長因子已被證明會影響胚胎在體外發(fā)育的速度、胚胎的質(zhì)量、囊胚細(xì)胞數(shù)量、胚胎的代謝和胚胎細(xì)胞凋亡。

3、落刺激因子是一組在體內(nèi)外均可選擇性刺激造血祖細(xì)胞增殖，分化形成某一譜系細(xì)胞集落的細(xì)胞因子，命名為集落刺激因子(colony?stimulating?factor，csf)。集落刺激因子能與造血干細(xì)胞表面的受體蛋白結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖并分化成特定類型的血細(xì)胞。根據(jù)其作用靶細(xì)胞不同，csf可分為四種：粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞csf(gm-csf)、粒細(xì)胞csf(g-csf)、巨噬細(xì)胞csf(m-csf)和多能集落刺激因子(multi-csf,通常稱為il-3)。其中，巨噬細(xì)胞csf(m-csf)又稱為集落刺激因子-1(csf-1)，最初發(fā)現(xiàn)于血清、尿或其它體液中。csf-1的作用由c-fms原癌基因編碼的高親和力受體酪氨酸激酶(csf-1r)3-5介導(dǎo)。其調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的存活、增殖和分化，同時也調(diào)節(jié)女性生殖道細(xì)胞的增殖和分化。

4、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming?growth?factor，tgf)是指兩類多肽類生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子-α和轉(zhuǎn)化生長因子-β。轉(zhuǎn)化生長因子-α是由巨噬細(xì)胞、腦細(xì)胞和表皮細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)上皮發(fā)育。轉(zhuǎn)化生長因子-β有三個亞型，分別為tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3。轉(zhuǎn)化生長因子-α是一種小分子多肽。其與細(xì)胞表面的受體表皮生長因子受體(egfr)結(jié)合，激發(fā)受體內(nèi)的酪氨酸激酶的活性，從而啟動信號傳導(dǎo)而導(dǎo)致多種生物化學(xué)反應(yīng)。其中，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升，增加糖酵解與蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)一些基因(包括表皮生長因子受體)的表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

5、缺乏集落刺激因子-1(csf-1)的小鼠的囊胚細(xì)胞數(shù)量減少，而缺乏轉(zhuǎn)化生長因子-α(tgf-a)的小鼠的囊胚細(xì)胞凋亡水平與野生型小鼠相比更高。csf-1增加滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞數(shù)量。tgf-a作用于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和局部極性滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞內(nèi)的受體，在培養(yǎng)基中添加tgf-a可降低體外培養(yǎng)的小鼠囊胚細(xì)胞的凋亡。

6、現(xiàn)有技術(shù)us20020028509a1公開了在體外細(xì)胞培養(yǎng)組合物中可添加包括至少兩個生長因子選自:肝生長因子，也稱為hgf，轉(zhuǎn)化生長因子α，也稱為tgf-α，粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子，也稱為gm-csf，表皮生長因子，也稱為egf和/或hb-egf，生長和分化因子，也稱為gdf，如gdf-9，胰島素樣生長因子，也稱為igf，如igf-1和/或igf-2。該技術(shù)缺點(diǎn)是未明確具體的生長因子組合且促胚胎生長效果較差。

7、對于反復(fù)妊娠丟失患者的胚胎在體外培養(yǎng)期間，目前生殖中心采用和常規(guī)胚胎同樣的培養(yǎng)液且無特殊處理。這些胚胎在體外培養(yǎng)常會出現(xiàn)囊胚質(zhì)量差且囊胚率低的現(xiàn)象，并且多數(shù)會被直接丟棄。因此，現(xiàn)在急需一種專門用于反復(fù)妊娠丟失患者胚胎的囊胚培養(yǎng)液，優(yōu)化不良胚胎的體外培養(yǎng)環(huán)境，提高其發(fā)育潛能，從而改善這類患者的生育結(jié)局，對于渴望擁有孩子的夫婦具有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種改良型囊胚培養(yǎng)液及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明基于常規(guī)囊胚培養(yǎng)液的配方，添加了集落刺激因子-1(csf-1)和轉(zhuǎn)化生長因子-α(tgf-α)，且集落刺激因子-1和轉(zhuǎn)化生長因子-α按照0.02-0.06mmol/l和0.01-0.05mmol/l的濃度溶解于常規(guī)培養(yǎng)液中，制備方法簡單，得到的改良型囊胚培養(yǎng)液能夠在體外培養(yǎng)中提高桑葚胚形成率或者囊胚形成率、促進(jìn)低質(zhì)量胚胎的發(fā)育、提高桑葚胚質(zhì)量或者囊胚質(zhì)量，可用于制備促進(jìn)胚胎著床或后續(xù)生長發(fā)育的藥物。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種改良型囊胚培養(yǎng)液，所述改良型囊胚培養(yǎng)液同時包含集落刺激因子-1和轉(zhuǎn)化生長因子-α，且集落刺激因子-1濃度為0.02-0.06mmol/l，轉(zhuǎn)化生長因子-α濃度為0.01-0.05mmol/l。

4、優(yōu)選地，所述集落刺激因子-1濃度為0.03-0.05mmol/l，轉(zhuǎn)化生長因子-α濃度為0.02-0.04mmol/l。

5、優(yōu)選地，所述集落刺激因子-1濃度為0.04mmol/l，所述轉(zhuǎn)化生長因子-α濃度為0.03mmol/l。

6、另一方面，本發(fā)明提供了上述改良型囊胚培養(yǎng)液的制備方法，包括以下步驟：

7、s1、配制常規(guī)囊胚培養(yǎng)液；

8、s2、將集落刺激因子-1和轉(zhuǎn)化生長因子-α溶解于步驟s1制得的常規(guī)囊胚培養(yǎng)液中；

9、s3、檢測并保持步驟s2所得培養(yǎng)液的滲透壓和ph值；

10、s4、將步驟s3所得溶液通過濾膜過濾滅菌，得到改良型囊胚培養(yǎng)液。

11、優(yōu)選地，步驟s1中所述常規(guī)囊胚培養(yǎng)液的組分包含：谷氨酸0.08-0.13mmol/l、門冬氨酸0.08-0.13mmol/l、鹽酸組氨酸0.17-0.23mmol/l、鹽酸精氨酸0.58-0.63mmol/l、異亮氨酸0.37-0.42mmol/l、亮氨酸0.37-0.42mmol/l、甲硫氨酸0.08-0.12mmol/l、苯丙氨酸0.18-0.23mmol/l、丙氨酸0.08-0.13mmol/l、甘氨酸0.08-0.13mmol/l、脯氨酸0.08-0.13mmol/l、絲氨酸0.08-0.13mmol/l、門冬酰胺0.08-0.13mmol/l、纈氨酸0.38-0.42mmol/l、鹽酸賴氨酸0.38-0.42mmol/l、蘇氨酸0.38-0.42mmol/l、胱氨酸0.08-0.13mmol/l、色氨酸0.48-0.53mmol/l、酪氨酸0.17-0.22mmol/l、牛磺酸0.08-0.13mmol/l、丙氨酰谷氨酰胺0.90-1.10mmol/l、氯化鈉95.60-100.60mmol/l、氯化鉀5.30-5.80mmol/l、硫酸鎂0.90-1.20mmol/l、磷酸二氫鉀0.23-0.27mmol/l、氯化鈣1.60-1.90mmol/l、無水葡萄糖3.11-3.17mmol/l、丙酮酸鈉0.08-0.13mmol/l、碳酸氫鈉23.00-27.00mmol/l、乳酸鈉5.85-5.86mmol/l、氯化膽堿0.0052-0.0072mmol/l、泛酸鈣0.0011-0.0021mmol/l、葉酸0.0016-0.0023mmol/l、煙酰胺0.0077-0.0082mmol/l、鹽酸吡哆醛0.0045-0.0049mmol/l、核黃素0.0001-

12、0.0003mmol/l、鹽酸硫胺0.0020-0.0030mmol/l、肌醇0.0106-0.0111mmol/l、硫酸慶大霉素8-12mg/l和人血白蛋白4-6g/l。

13、優(yōu)選地，所述常規(guī)囊胚培養(yǎng)液的組分包含：谷氨酸0.08-0.10mmol/l、門冬氨酸0.08-0.10mmol/l、鹽酸組氨酸0.17-0.19mmol/l、鹽酸精氨酸0.58-0.61mmol/l、異亮氨酸0.37-0.39mmol/l、亮氨酸0.37-0.39mmol/l、甲硫氨酸0.08-0.10mmol/l、苯丙氨酸0.18-0.20mmol/l、丙氨酸0.08-0.10mmol/l、甘氨酸0.08-0.10mmol/l、脯氨酸0.08-0.10mmol/l、絲氨酸0.08-0.10mmol/l、門冬酰胺0.08-0.10mmol/l、纈氨酸0.38-0.40mmol/l、鹽酸賴氨酸0.38-0.40mmol/l、蘇氨酸0.38-0.40mmol/l、胱氨酸0.08-0.10mmol/l、色氨酸0.48-0.51mmol/l、酪氨酸0.17-0.20mmol/l、?；撬?.08-0.11mmol/l、丙氨酰谷氨酰胺1.00-1.10mmol/l、氯化鈉95.60-98.60mmol/l、氯化鉀5.30-5.60mmol/l、硫酸鎂0.90-1.10mmol/l、磷酸二氫鉀0.24-0.26mmol/l、氯化鈣1.70-1.80mmol/l、無水葡萄糖3.13-3.15mmol/l、丙酮酸鈉0.09-0.12mmol/l、碳酸氫鈉24.00-26.00mmol/l、乳酸鈉5.85-5.86mmol/l、氯化膽堿0.0052-0.0062mmol/l、泛酸鈣0.0013-0.0019mmol/l、葉酸0.0018-0.0021mmol/l、煙酰胺0.0079-0.0081mmol/l、鹽酸吡哆醛0.0046-0.0048mmol/l、核黃素0.0001-0.0003mmol/l、鹽酸硫胺0.0022-0.0028mmol/l、肌醇0.0107-0.0110mmol/l、硫酸慶大霉素9-11mg/l和人血白蛋白4.5-5.5g/l。

14、具體地，步驟s1中所述常規(guī)囊胚培養(yǎng)液的組分包含：谷氨酸0.09mmol/l、門冬氨酸0.09mmol/l、鹽酸組氨酸0.18mmol/l、鹽酸精氨酸

15、0.60mmol/l、異亮氨酸0.38mmol/l、亮氨酸0.38mmol/l、甲硫氨酸

16、0.09mmol/l、苯丙氨酸0.19mmol/l、丙氨酸0.09mmol/l、甘氨酸

17、0.09mmol/l、脯氨酸0.09mmol/l、絲氨酸0.09mmol/l、門冬酰胺

18、0.09mmol/l、纈氨酸0.39mmol/l、鹽酸賴氨酸0.39mmol/l、蘇氨酸0.39mmol/l、胱氨酸0.09mmol/l、色氨酸0.49mmol/l、酪氨酸0.18mmol/l、?；撬?.10mmol/l、丙氨酰谷氨酰胺1.00mmol/l、氯化鈉97.60mmol/l、氯化鉀5.44mmol/l、硫酸鎂1.00mmol/l、磷酸二氫鉀0.25mmol/l、氯化鈣1.75mmol/l、無水葡萄糖3.15mmol/l、丙酮酸鈉0.10mmol/l、碳酸氫鈉

19、25.00mmol/l、乳酸鈉5.85mmol/l、氯化膽堿0.0060mmol/l、泛酸鈣0.0015mmol/l、葉酸0.0020mmol/l、煙酰胺0.0080mmol/l、鹽酸吡哆醛

20、0.0047mmol/l、核黃素0.0002mmol/l、鹽酸硫胺0.0025mmol/l、肌醇0.0108mmol/l、硫酸慶大霉素10mg/l和人血白蛋白5g/l。

21、優(yōu)選地，所述步驟s1包含上述的各個組分依次稱量并溶于注射級用水中，溶解過程中遵循先固體后液體的原則。

22、優(yōu)選地，所述注射級用水經(jīng)0.1-0.3μm濾膜過濾，內(nèi)毒素經(jīng)檢測小于0.5eu/ml。

23、優(yōu)選地，所述注射級用水經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

24、優(yōu)選地，步驟s3中所述滲透壓保持為265-295mosm/kg。

25、優(yōu)選地，步驟s3中所述ph值保持為7.8-8.2。

26、優(yōu)選地，所述步驟s4包含將步驟s3所得溶液通過0.22μm濾膜過濾滅菌。

27、另一方面，本發(fā)明提供了上述改良型囊胚培養(yǎng)液或者上述制備方法在胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。

28、優(yōu)選地，所述胚胎細(xì)胞包括桑葚胚和囊胚。

29、優(yōu)選地，所述應(yīng)用選自以下應(yīng)用中的一種或多種：

30、1)制備提高桑葚胚形成率或者囊胚形成率藥物中的應(yīng)用；

31、2)制備促進(jìn)低質(zhì)量胚胎的發(fā)育藥物中的應(yīng)用；

32、3)制備提高桑葚胚質(zhì)量或者囊胚質(zhì)量藥物中的應(yīng)用；

33、4)制備促進(jìn)胚胎著床或后續(xù)生長發(fā)育藥物中的應(yīng)用。

34、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

35、1、本發(fā)明公開的改良型囊胚培養(yǎng)液只需在常規(guī)囊胚培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加集落刺激因子-1和轉(zhuǎn)化生長因子-α，制備方法簡單；

36、2、本發(fā)明公開的改良型囊胚培養(yǎng)液能夠在體外培養(yǎng)中提高桑葚胚形成率或者囊胚形成率、促進(jìn)低質(zhì)量胚胎的發(fā)育、提高桑葚胚質(zhì)量或者囊胚質(zhì)量，可用于制備促進(jìn)胚胎著床或后續(xù)生長發(fā)育的藥物。