本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域。具體的，本發(fā)明提供了一種精原干細(xì)胞系和其制備方法。

背景技術(shù)：

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial?stem?cells,sscs)是位于睪丸生精小管基底層的未分化生殖細(xì)胞，具有自我更新和定向分化為精子的雙重能力。作為雄性生殖系發(fā)育的核心細(xì)胞群體，sscs通過(guò)不對(duì)稱分裂維持干細(xì)胞池穩(wěn)態(tài)，同時(shí)生成分化型精原祖細(xì)胞(spermatogonial?progenitor?cells,spcs)，最終通過(guò)減數(shù)分裂形成成熟配子。sscs的標(biāo)志性分子包括plzf、gfrα1、ret和nanos2等。

2、建立穩(wěn)定精原干細(xì)胞系對(duì)生物學(xué)的研究工作有重要的意義，包括可用于研究男性不育機(jī)制和生殖技術(shù)開(kāi)發(fā)。sscs的體外培養(yǎng)為解析生精障礙(如非梗阻性無(wú)精癥)的分子機(jī)制提供模型。穩(wěn)定ssc系可用于基因編輯(如crispr/cas9介導(dǎo)的遺傳修飾)和自體移植，為遺傳性不育或放化療后生育力保存提供策略。另外，精原干細(xì)胞系還可以作為毒性評(píng)價(jià)平臺(tái)，通過(guò)監(jiān)測(cè)sscs的增殖與分化能力，評(píng)估環(huán)境毒素或藥物對(duì)生殖系統(tǒng)的潛在危害。

3、已有研究建立了經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(如馬口魚(yú))的長(zhǎng)期精原干細(xì)胞系，解決了魚(yú)類干細(xì)胞體外存活時(shí)間短的問(wèn)題。相對(duì)于魚(yú)類，哺乳動(dòng)物的精原干細(xì)胞的制備和培養(yǎng)需更復(fù)雜的微環(huán)境支持。

4、本領(lǐng)域還需要對(duì)哺乳動(dòng)物的精原干細(xì)胞的干性機(jī)制有更廣泛的研究，開(kāi)發(fā)在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)和維持干性的精原干細(xì)胞系的方法和培養(yǎng)基。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)提供了新的精原干細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。通過(guò)本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)和維持干性的精原干細(xì)胞系。

2、具體的，本發(fā)明提供了一種哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞系的制備方法，其包括以下步驟：

3、步驟1：從哺乳動(dòng)物的睪丸純化和培養(yǎng)精原干細(xì)胞；

4、步驟2：將步驟1得到的精原干細(xì)胞進(jìn)行1-3代傳代培養(yǎng)；

5、步驟3：將步驟2得到的精原干細(xì)胞在飼養(yǎng)層(例如為胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)多代的傳代培養(yǎng)，獲得精原干細(xì)胞系。

6、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述方法中步驟1包括以下步驟：

7、(1)膠原酶消化睪丸組織；

8、(2)胰蛋白酶消化；

9、(3)純化：去除體細(xì)胞，得到精原干細(xì)胞；

10、(4)得到的精原干細(xì)胞在精原干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

11、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中步驟1包括以下步驟：

12、(1)睪丸分離：從哺乳動(dòng)物例如小鼠分離和獲得睪丸；

13、(2)膠原酶消化，例如為在1mg/ml膠原酶中消化約10-20分鐘；

14、(3)胰蛋白酶消化，例如為在膠原酶消化后，用0.05％胰酶消化約2-8分鐘，然后終止消化；

15、(4)純化：通過(guò)差異貼壁法去除體細(xì)胞，得到精原干細(xì)胞，在精原干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

16、在本發(fā)明中，通過(guò)所述步驟1可得到睪丸來(lái)源的富集或純化的精原干細(xì)胞。

17、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中步驟1中純化得到的精原干細(xì)胞在培養(yǎng)15-30天后進(jìn)行步驟2的傳代培養(yǎng)。

18、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中步驟1中純化得到的精原干細(xì)胞在培養(yǎng)至克隆團(tuán)密度大于60％，優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％后進(jìn)行步驟2的傳代培養(yǎng)。

19、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中步驟2的傳代培養(yǎng)進(jìn)行1-3代，優(yōu)選的，進(jìn)行3代。

20、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中步驟3的傳代培養(yǎng)進(jìn)行20代以上，優(yōu)選為進(jìn)行30代以上。

21、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中飼養(yǎng)層(例如為胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層)的密度大于80％，優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于95％。

22、在本發(fā)明中，前述方法中，所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)基為適合干細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)基(或培養(yǎng)液)，其包括維持干細(xì)胞的增殖能力、發(fā)育潛能和干性等。可用于本發(fā)明的干細(xì)胞培養(yǎng)基可以商購(gòu)的形式提供和獲得。可用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可以商購(gòu)的形式提供和獲得。

23、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)基包含各種適合培養(yǎng)細(xì)胞，特別是干細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有促進(jìn)細(xì)胞增殖的營(yíng)養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，一般含有等滲鹽水、緩沖液、蛋白質(zhì)來(lái)源(一種或多種添加的蛋白質(zhì)或氨基酸的形式)和其它外部添加的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子?？捎糜诒景l(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基可以商購(gòu)的形式提供和獲得，例如包括dmem(dulbecco's?modified?eaglemedium)，ko?dmem(knockout?dmem)，f12/50％?dmem，stempro-34sfm，stempro-34supplement等。

24、可用于本發(fā)明所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)基的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、丙酮酸鈉、孕酮、β-雌二醇和β-巰基乙醇等?？捎糜诒景l(fā)明所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)基的生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子egf、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子gdnf、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bfgf、白血病抑制因子lif等細(xì)胞因子。值得留意的是，在本發(fā)明的精原干細(xì)胞培養(yǎng)基不包括胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明用于建立穩(wěn)定精原干細(xì)胞系的方法中，在培養(yǎng)精原干細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入胰島素，會(huì)導(dǎo)致破壞精原干細(xì)胞生長(zhǎng)(典型現(xiàn)象為干細(xì)胞出現(xiàn)萎縮)甚至引起精原干細(xì)胞死亡。

25、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中所述干細(xì)胞培養(yǎng)液中含有胎牛血清(fbs)。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中所述干細(xì)胞培養(yǎng)液中含有維生素。

26、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中所述干細(xì)胞培養(yǎng)液中還含有非必需氨基酸，例如含有甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺/谷氨酸酪氨酸、脯氨酸、絲氨酸中的一種或多種。

27、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述方法中所述干細(xì)胞培養(yǎng)液中還含有抗生素。

28、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)基包含：stempro34?sfm?base+1xstempro34?nutrient?supplement+5mg/ml牛血清白蛋白bsa+6mg/ml葡萄糖+2mm?glutamax+1x非必需氨基酸neaa+1x青鏈霉素雙抗+1x?mem?vitamins+10μg/ml生物素d-biotin+30μg/ml丙酮酸鈉+0.06％乳酸+100μm抗壞血酸+30nm亞硒酸鈉+60μm腐胺+100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+60ng/ml孕酮+30ng/mlβ-雌二醇+10μmβ-巰基乙醇+1％?fbs+20ng/ml?egf+20ng/ml?gdnf+10ng/ml?bfgf+1x103?u/ml?lif。

29、在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，提供的哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞系的制備方法包括以下步驟：

30、步驟1：從睪丸分離，純化和培養(yǎng)精原干細(xì)胞；

31、(1)睪丸處理：從哺乳動(dòng)物例如小鼠獲得睪丸，用緩沖液去除血細(xì)胞，去除睪丸表面的白膜，對(duì)睪丸組織分成小塊；

32、(2)膠原酶消化：將睪丸組織小塊轉(zhuǎn)移至1mg/ml膠原酶中約37℃消化約15分鐘；

33、(3)胰蛋白酶消化：膠原酶消化后，用0.05％胰酶在約37℃下消化約5分鐘，然后加10％?fbs或者5-8ml的含10％?fbs的mef培養(yǎng)基終止消化；

34、(4)純化：用40μm細(xì)胞篩過(guò)濾后，收集濾液和離心，棄上清，然后用sscs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，然后將細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)板孔中，過(guò)夜差速貼壁，次日，輕輕吹打培養(yǎng)板底部，收集上清進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3天半量換液一次；

35、步驟2：將步驟1得到的精原干細(xì)胞進(jìn)行1-3代傳代培養(yǎng)，優(yōu)先的，進(jìn)行3代傳代培養(yǎng)。

36、步驟3：將步驟2得到的精原干細(xì)胞在胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

37、本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞系。在其中一種實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞系通過(guò)前述方法制備得到。