本發(fā)明涉及一株產(chǎn)l-蘋果酸的東方伊薩酵母菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用，屬于微生物。

背景技術(shù)：

1、l-蘋果酸(l-malic?acid，c4h6o5)是一種重要的有機酸，又稱2-羥基丁二酸，呈白色晶體或粉末，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。作為檸檬酸循環(huán)(tca循環(huán))的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，l-蘋果酸在能量和碳源代謝中發(fā)揮重要作用。此外，l-蘋果酸還是一種潛在的生物基化學(xué)品，可用于合成可降解材料、綠色塑料等替代石油基產(chǎn)品，具有顯著的工業(yè)和環(huán)保價值。

2、傳統(tǒng)的l-蘋果酸生產(chǎn)主要依賴化學(xué)合成或提取，但其工藝復(fù)雜、成本高且易污染環(huán)境。而微生物發(fā)酵因其綠色、可持續(xù)、低污染的特點，逐漸成為一種新興的生產(chǎn)方式。當(dāng)前，已研究出多種微生物用于生產(chǎn)l-蘋果酸，如真菌(曲霉菌)、細菌(大腸桿菌)和酵母(釀酒酵母)。東方伊薩酵母(issatchenkia?orientalis)，作為一種非傳統(tǒng)酵母菌，因其耐酸性強、環(huán)境適應(yīng)性好而顯示出工業(yè)發(fā)酵潛力，尤其適合生產(chǎn)多種有機酸。此外，東方伊薩酵母能通過crispr-cas9基因編輯進行代謝改造，進一步提升l-蘋果酸的生產(chǎn)效率。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一株產(chǎn)l-蘋果酸的東方伊薩酵母，命名為東方伊薩酵母(issatchenkia?orientalis)fio-10。通過代謝工程改造，改造東方伊薩酵母菌株的胞質(zhì)rtca代謝路徑，敲除丙酮酸脫羧酶編碼基因pdc1以減少乙醇積累，敲除甘油脫氫酶gpd1以減少甘油積累，敲除乳酸脫氫酶d-ldh3、d-ldh2和l-ldh2以減少乳酸生成；篩選并整合了黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶基因afpyc、谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶基因cgmdh和大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ecppc，而增強胞質(zhì)rtca循環(huán)合成通路；在基因編輯過程中，通過在基因組預(yù)先整合著陸墊的方式增加基因組同一grna的數(shù)量，通過一次基因編輯，使afpyc、cgmdh和ecppc的基因組拷貝數(shù)分別增加至2、3、1個，以優(yōu)化l-蘋果酸生成。

2、本發(fā)明還提供了一種經(jīng)遺傳改造的l-蘋果酸生產(chǎn)酵母菌株，所述l-蘋果酸生產(chǎn)酵母菌株是以酵母菌株為底盤細胞，其具有或具有增強的蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白活性例如spmae1蛋白活性；及具有或具有增強的蘋果酸脫氫酶活性；及具有或具有增強的丙酮酸脫羧酶活性；

3、任選地，還具有降低活性的或失活的以下至少之一：

4、(i)降低活性的或失活基因組上的ura3基因，獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，(ii)降低活性的或失活基因組上的丙酮酸脫羧酶基因pdc1，(iii)降低活性的或失活基因組上的內(nèi)源性二羧酸內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白jen2-1，(iv)降低活性的或失活基因組上的甘油脫氫酶編碼基因gpd1；

5、優(yōu)選地，所述蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白選自spmae1蛋白；

6、優(yōu)選地，所述丙酮酸脫羧酶來自黃曲霉；

7、優(yōu)選地，所述蘋果酸脫氫酶來自谷氨酸棒桿菌。

8、本發(fā)明提供了一種所述重組酵母菌株以酵母菌株為底盤細胞，其過表達了本源的丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶，并表達了谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶、黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶、粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白；或所述重組酵母菌株以酵母菌株為底盤細胞，其過表達了本源的丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶，并表達了谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶、黃曲霉的丙酮酸羧化酶、粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白、大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；

9、同時，所述重組酵母菌株還含有如下改造：

10、在酵母的基因組上插入seq?id?no.1所示的著陸墊1及seq?id?no.3所示的著陸墊2；并且具有降低活性的或失活的以下基因：

11、(i)降低活性的或失活基因組上的ura3基因，獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，(ii)降低活性的或失活基因組上的丙酮酸脫羧酶基因pdc1，(iii)降低活性的或失活基因組上的內(nèi)源性二羧酸內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白jen2-1，(iv)降低活性的或失活基因組上的甘油脫氫酶編碼基因gpd1。

12、在本發(fā)明的一種實施方式中，過表達本源的丙酮酸羧化酶為，將本源的丙酮酸羧化酶iopyc在酵母的基因組上過表達，整合的拷貝數(shù)為2個或2個以上；

13、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述本源的丙酮酸羧化酶iopyc在酵母的基因組上過表達，是將本源丙酮酸羧化酶iopyc整合至基因組上的eg4位點和/或丙酮酸脫羧酶基因pdc1位點；

14、在本發(fā)明的一種實施方式中，過表達本源的蘋果酸脫氫酶為，將本源的蘋果酸脫氫酶iomdh3在酵母的基因組上過表達，整合的拷貝數(shù)為1個或1個以上；進一步地，所述本源的蘋果酸脫氫酶iomdh3在酵母的基因組上過表達，是將本源蘋果酸脫氫酶整合至基因組上的eg14位點；

15、在本發(fā)明的一種實施方式中，表達了谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶為，將谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh整合至酵母的基因組上，整合的拷貝數(shù)為3個或3個以上；進一步地，所述谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh整合至酵母的基因組上，是將谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh整合至基因組上的乳酸脫氫酶d-ldh2、gpd1和jen2-1位點；

16、在本發(fā)明的一種實施方式中，表達了黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶為，將黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶afpyc整合至酵母的基因組上，整合的拷貝數(shù)為2個或2個以上；進一步地，所述黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶afpyc整合至酵母的基因組上，是將黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶afpyc整合至基因組上的gd5位點；

17、在本發(fā)明的一種實施方式中，表達了粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白為，將粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白spmae1整合至酵母的基因組上，整合的拷貝數(shù)為1個或1個以上；進一步地，所述粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白spmae1整合至酵母的基因組上，是將粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白spmae1整合至基因組上的gd21位點；

18、在本發(fā)明的一種實施方式中，表達了大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶為，將大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ecppc整合至酵母的基因組上，整合的拷貝數(shù)為1個或1個以上；進一步地，所述大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶整合至酵母的基因組上，是將大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶整合至基因組上的乳酸脫氫酶l-ldh2位點；

19、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述著陸墊1插入的位點為基因組上的乳酸脫氫酶d-ldh3位點；

20、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述著陸墊2插入的位點為基因組上的內(nèi)源性二羧酸內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白jen2-1位點和/或甘油脫氫酶編碼基因gpd1位點。

21、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述本源的丙酮酸羧化酶iopyc的uniprot編號為：a0a099p575；所述本源的蘋果酸脫氫酶iomdh3的uniprot編號為：a0a099nxm1；

22、所述谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh的uniprot編號為：q8nn33或與其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有蘋果酸脫氫酶活性的氨基酸序列；

23、所述黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶aopyc的uniprot編號為：i8tve3或與其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有丙酮酸脫羧酶活性的氨基酸序列；

24、所述粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白的uniprot編號為：p50537或與其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有外轉(zhuǎn)運蛋白活性的氨基酸序列；

25、所述大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ecppc的uniprot編號為：p0abq0或與其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的氨基酸序列。

26、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酵母是以東方伊薩酵母、畢赤酵母、假絲酵母或紅酵母為宿主細胞；

27、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主細胞為東方伊薩酵母；進一步地，所述宿主細胞包括不限于東方伊薩酵母cicc?33427、東方伊薩酵母cicc?32694、東方伊薩酵母cicc1934。

28、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述乳酸脫氫酶基因d-ldh3(uniprot：a0a1v2ltz5)

29、所述eg4位點序列為：gtcgctgtcacgggatcacg；所述基因組上的gd5位點序列為：ctccgtatggctaagagtgcagg，所述gd21位點的序列為：ccatacgcaacaggtattaaaga；所述eg14位點序列為：cgtgtagtggttagac；所述d-ldh2位點序列為cctcattccagctatgcaagaat；所述l-ldh2位點序列為gaattcctggtgcaacacaatgg；

30、所述丙酮酸脫羧酶基因pdc1位點上的ncbi編號為：xm_029463167.1；

31、所述乳酸脫氫酶d-ldh3位點的uniprot：a0a1v2ltz5；所述內(nèi)源性二羧酸內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白jen2-1位點的ncbi編號為：xm_029463385.1；所述甘油脫氫酶編碼基因gpd1位點的ncbi編號為：xm_029463167.1；

32、所述cgmdh的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述spmae1的核苷酸序列如seq?idno.2所示，所述afpyc的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，所述ecppc的核苷酸序列如seq?idno.6所示。

33、在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明中，上述表達的酶均可采用常規(guī)的強啟動子進行表達，比如本源的丙酮酸羧化酶iopyc采用強啟動子ptef、ptdh3進行表達；本源的蘋果酸脫氫酶iomdh3采用強啟動子pfba進行表達；粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白spmae1采用seq?id?no.7所示的啟動子pgmp1進行表達；谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh采用seq?id?no.8所示的啟動子pipdc進行表達；黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶afpyc采用seq?idno.8所示的啟動子pipdc進行表達；大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ecppc采用seqid?no.9所示的啟動子psed進行表達。

34、本發(fā)明還提供了一種高產(chǎn)l-蘋果酸的酵母菌株的構(gòu)建方法，所述方法為，以酵母菌株為底盤細胞，過表達了本源的丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶，并表達了谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶、黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶、粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白；或所述重組酵母菌株以酵母菌株為底盤細胞，其過表達了本源的丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶，并表達了谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶、黃曲霉的丙酮酸羧化酶、粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白、大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；

35、同時，所述重組酵母菌株還含有如下改造：

36、在酵母的基因組上插入seq?id?no.1所示的著陸墊1及seq?id?no.3所示的著陸墊2；并且具有降低活性的或失活的以下基因：

37、(i)降低活性的或失活基因組上的ura3基因，獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，(ii)降低活性的或失活基因組上的丙酮酸脫羧酶基因pdc1，(iii)降低活性的或失活基因組上的內(nèi)源性二羧酸內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白jen2-1，(iv)降低活性的或失活基因組上的甘油脫氫酶編碼基因gpd1。

38、在本發(fā)明的一種實施方式中，過表達本源的丙酮酸羧化酶為，將本源的丙酮酸羧化酶iopyc在酵母的基因組上過表達，整合的拷貝數(shù)為2個或2個以上；

39、優(yōu)選地，所述本源的丙酮酸羧化酶iopyc在酵母的基因組上過表達，是將本源丙酮酸羧化酶iopyc整合至基因組上的eg4位點和/或丙酮酸脫羧酶基因pdc1位點；

40、優(yōu)選地，過表達本源的蘋果酸脫氫酶為，將本源的蘋果酸脫氫酶iomdh3在酵母的基因組上過表達，整合的拷貝數(shù)為1個或1個以上；進一步地，所述本源的蘋果酸脫氫酶iomdh3在酵母的基因組上過表達，是將本源蘋果酸脫氫酶整合至基因組上的eg14位點；

41、優(yōu)選地，表達了谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶為，將谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh整合至酵母的基因組上，整合的拷貝數(shù)為3個或3個以上；進一步地，所述谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh整合至酵母的基因組上，是將谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh整合至基因組上的乳酸脫氫酶d-ldh2位點；

42、優(yōu)選地，表達了黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶為，將黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶afpyc整合至酵母的基因組上，整合的拷貝數(shù)為2個或2個以上；進一步地，所述黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶afpyc整合至酵母的基因組上，是將黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶afpyc整合至基因組上的gd5位點；

43、優(yōu)選地，表達了粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白為，將粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白spmae1整合至酵母的基因組上，整合的拷貝數(shù)為1個或1個以上；進一步地，所述粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白spmae1整合個或至酵母的基因組上，是將粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白spmae1整合至基因組上的gd21位點；

44、優(yōu)選地，表達了大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶為，將大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ecppc整合至酵母的基因組上，整合的拷貝數(shù)為1個或1個以上；進一步地，所述大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶整合至酵母的基因組上，是將大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶整合至基因組上的乳酸脫氫酶l-ldh2位點；

45、優(yōu)選地，所述著陸墊1插入的位點為基因組上的乳酸脫氫酶d-ldh3位點；

46、優(yōu)選地，所述著陸墊2插入的位點為基因組上的內(nèi)源性二羧酸內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白jen2-1位點和/或甘油脫氫酶編碼基因gpd1位點。

47、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述本源的丙酮酸羧化酶iopyc的uniprot編號為：a0a099p575；所述本源的蘋果酸脫氫酶iomdh3的uniprot編號為：a0a099nxm1；

48、所述谷氨酸棒桿菌來源的蘋果酸脫氫酶cgmdh的uniprot編號為：q8nn33或與其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有蘋果酸脫氫酶活性的氨基酸序列；

49、所述黃曲霉來源的丙酮酸羧化酶aopyc的uniprot編號為：i8tve3或與其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有丙酮酸脫羧酶活性的氨基酸序列；

50、所述粟酒裂殖酵母來源的二羧酸外轉(zhuǎn)運蛋白的uniprot編號為：p50537或與其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有外轉(zhuǎn)運蛋白活性的氨基酸序列；

51、所述大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ecppc的uniprot編號為：p0abq0或與其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的氨基酸序列。

52、優(yōu)選地，所述酵母是以東方伊薩酵母、畢赤酵母、假絲酵母或紅酵母為宿主細胞；

53、優(yōu)選地，所述宿主細胞為東方伊薩酵母；進一步地，所述宿主細胞包括不限于東方伊薩酵母cicc?33427、東方伊薩酵母cicc?32694、東方伊薩酵母cicc?1934。

54、在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明制備得到的菌株fio-09為：fioδeg4::ptef-iopycδeg14::pfba-iomdh3δpdc1::ptdh3-iopycδd-ldh3::著陸墊1δgd21::pgmp1-spmae1δgd21::pgmp1-spmae1δjen2-1::著陸墊2δgpd1::著陸墊2δd-ldh2::pipdc-cgmdhδd-ldh2::pipdc-cgmdhδd-ldh2::pipdc-cgmdhδgd5::pipdc-afpycδgd5::pipdc-afpyc。

55、所述fio可以為：東方伊薩酵母cicc?33427、東方伊薩酵母cicc?32694、東方伊薩酵母cicc?1934中的任一種。

56、在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明制備得到的菌株fio-10為：fioδeg4::ptef-iopycδeg14::pfba-iomdh3δpdc1::ptdh3-iopycδd-ldh3::著陸墊1δgd21::pgmp1-spmae1δgd21::pgmp1-spmae1δjen2-1::著陸墊2δgpd1::著陸墊2δd-ldh2::pipdc-cgmdhδd-ldh2::pipdc-cgmdhδd-ldh2::pipdc-cgmdhδgd5::pipdc-afpycδgd5::pipdc-afpycδl-ldh2::psed-ecppc。

57、所述fio可以為：東方伊薩酵母cicc?33427、東方伊薩酵母cicc?32694、東方伊薩酵母cicc?1934中的任一種。

58、本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)l-蘋果酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述的經(jīng)遺傳改造的l-蘋果酸生產(chǎn)酵母菌株或者根據(jù)上述方法制備的經(jīng)遺傳改造的蘋果酸生產(chǎn)酵母菌株，發(fā)酵制備l-蘋果酸。

59、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法為，將所述重組酵母菌株或蘋果酸生產(chǎn)酵母菌株種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加30～150g/l的碳酸鈣，在溫度為：25～35℃、轉(zhuǎn)速為：250～350rpm、ph?5～6的條件下反應(yīng)48～72h。

60、在本發(fā)明的一種實施方式中，將蘋果酸生產(chǎn)酵母菌株種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加30g/l的碳酸鈣，在溫度為：30℃、轉(zhuǎn)速為：300rpm，通氣0.67vvm，發(fā)酵ph為：通過補加碳酸鈣維持ph5～6的條件下反應(yīng)72h，制備得到l-蘋果酸。

61、在本發(fā)明的一種實施方式中，種子液的制備方法為：

62、從平板上挑去生長良好的單菌落，并接種至裝有ypd培養(yǎng)基中，在300rpm，30℃恒溫培養(yǎng)約24h，至od600值在10左右；

63、將上述一級種子液以od600＝0.5的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，同時加入10g/l碳酸鈣，在200rpm，30℃恒溫培養(yǎng)約12h，至od600值在10-15左右；

64、本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)l-蘋果酸的方法，包括將上述東方伊薩酵母接種于發(fā)酵體系中，通過發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋果酸。

65、在本發(fā)明的一種實施方式中，發(fā)酵體系中含有100g/l葡萄糖，5g/l酵母粉，2g/l硫酸銨，1g/l七水硫酸鎂，0.5g/l磷酸二氫鉀，2g/l尿嘧啶，維生素液10ml/l(肌醇10g/l，煙酰胺5g/l，組氨酸5g/l，蘇氨酸10g/l，色氨酸10g/l，亮氨酸10g/l，泛酸鈣5g/l，纈氨酸5g/l)，金屬離子液200μl/l(feso4?7h20?50g/l，mnso4?h2o?175mg/l，cuso4?5h2o?500mg/l，cacl22h20?1g/l，znso47h20?1g/l，na2b4o7?10h2o?100mg/l，h8mon2o4?4h2o?53.29mg/l)。

66、在本發(fā)明的一種實施方式中，接種量為1od/ml，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期72小時，攪拌速度300rpm，通氣量0.67vvm。

67、在發(fā)酵過程中添加碳酸鈣以保持ph?5.0至6.0，當(dāng)葡萄糖濃度降至10g/l以下時，補加800g/l的葡萄糖，使發(fā)酵液葡萄糖濃度達到約40g/l。

68、本發(fā)明還提供了一種基因編輯技術(shù)，用于在東方伊薩酵母中快速整合多個目的基因或同時編輯多個基因位點。

69、在一種實施方式中，在酵母基因組預(yù)先整合了可識別的grna著陸墊序列，通過一次性醋酸鋰轉(zhuǎn)化和crispr-cas9系統(tǒng)，可實現(xiàn)多基因位點同步編輯。

70、本發(fā)明還包括權(quán)利要求1至3所述的酵母菌株、微生物菌劑、l-蘋果酸的生產(chǎn)方法以及所述基因編輯技術(shù)在東方伊薩酵母中的應(yīng)用。

71、本發(fā)明還提供了上述經(jīng)遺傳改造的l-蘋果酸生產(chǎn)酵母菌株或者上述方法在制備l-蘋果酸或含有l(wèi)-蘋果酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

72、有益效果

73、本發(fā)明以issatchenkia?orientalis?fio為出發(fā)菌株，通過代謝工程改造，獲得一株高產(chǎn)l-蘋果酸的東方伊薩酵母，命名為fio-10。在5l發(fā)酵罐l-蘋果酸產(chǎn)量可達到140.16g/l，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為87.82％。