本發(fā)明屬于細胞工程領域，具體涉及一種永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系的制備方法。

背景技術：

1、麋鹿(elaphurus?davidianus)是我國特有物種，俗稱“四不像”，現(xiàn)被列為我國一級保護動物，同時收錄于世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄(iucn)。目前麋鹿保護主要采用活體保種方式，離體保護作為遺傳資源保護的重要方式，在麋鹿的保種方面應用較少。

2、迄今為止，保存動物遺傳物質的技術已成功開發(fā)，包括動物個體、胚胎、配子、性腺組織和各種細胞系。由于現(xiàn)代體細胞核移植在生物多樣性保護、多能性和胚胎發(fā)育研究中的廣泛應用，體細胞保存引起了極大的關注。與生殖細胞和胚胎相比，體細胞的冷凍保存被認為是一種有吸引力和潛力的種質資源保護手段，特別是對于極度瀕危的物種，以及難以接近或已經死亡的珍貴動物，體細胞提供了一種可行的、實用的、及時的遺傳物質備份，同時也克服了動物實驗的局限。

3、原代細胞分離、培養(yǎng)困難，且容易衰老，經過有限次的細胞傳代后，就會停止增殖，發(fā)生衰老和死亡，極大地限制了細胞的應用。建立具有無限增殖能力的理想永生化細胞系，并保持其來源組織細胞的特性，不僅可以避免原代細胞分離純化的復雜過程，減少研究人員的時間和精力消耗，節(jié)省實驗成本，也有利于動物基因功能等科學問題的研究，迅速推動科學的發(fā)展。常見的不引起任何癌癥發(fā)生的細胞永生化方法主要是通過外源引入htert基因，促進端粒酶活性，或引入sv40t，到目前為止，在這些細胞系的培養(yǎng)過程中尚未觀察到非錨定生長、染色體異常和致瘤性轉化。為克服原代細胞分離培養(yǎng)困難、傳代次數(shù)短等問題，擬通過外源引入sv40t建立永生化麋鹿成纖維細胞，對遺傳學、病毒學、毒理學和流行病學等方面的研究提供試驗材料具有顯著的意義。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明目的是提供一種永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系的制備方法，通過胰蛋白酶與膠原酶聯(lián)合消化法，分離培養(yǎng)原代麋鹿皮膚成纖維細胞，細胞經過純化之后進行鑒定；然后克隆sv40t基因，連接至載體，轉染293t細胞，獲得穩(wěn)定轉染慢病毒，利用穩(wěn)定轉染慢病毒轉染原代麋鹿皮膚成纖維細胞，用嘌呤霉素進行篩選，得到了永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的技術方案是：

3、一種永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系的制備方法，包括以下步驟：

4、s1.優(yōu)化細胞完全培養(yǎng)基；

5、s2.通過胰蛋白酶與膠原酶聯(lián)合消化法，分離培養(yǎng)并純化原代麋鹿皮膚成纖維細胞；

6、s3.對s2純化后的原代麋鹿皮膚成纖維細胞的波形蛋白和角蛋白的表達進行鑒定和驗證；

7、s4.克隆sv40t基因并構建sv40t基因慢病毒表達載體ef1a-sv40t-t2a-puro，將sv40t基因慢病毒表達載體轉染至293t細胞中，獲得穩(wěn)定轉染sv40t基因慢病毒；

8、s5.使用s4獲得的sv40t基因慢病毒侵染s2純化后的原代麋鹿皮膚成纖維細胞；用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行兩次篩選，傳代得到穩(wěn)定轉染的永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系。

9、優(yōu)選的，

10、所述s1優(yōu)化細胞完全培養(yǎng)基具體為：

11、在完全培養(yǎng)基中分別添加了三種生長因子：人表皮生長因子、成纖維細胞生長因子1和成纖維細胞生長因子2，以10:1:3比例混合添加，檢測三種生長因子添加對細胞的增殖的影響，得出當成纖維細胞生長因子2單獨加入培養(yǎng)基時，成纖維細胞的生長速度更快；

12、確定優(yōu)化的細胞完全培養(yǎng)基中添加成纖維細胞生長因子2，添加量為3ng/ml。

13、優(yōu)選的，

14、所述s4中sv40t基因慢病毒的感染復數(shù)為moi＝50：1。

15、優(yōu)選的，

16、所述s4中嘌呤霉素的篩選濃度為2μg/ml。

17、優(yōu)選的，

18、所述s1原代麋鹿皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng)包括以下步驟：

19、s1.1取麋鹿皮膚組織并進行預處理，將其剪碎并加入1％胰蛋白酶消化20min，之后進一步剪碎并加入2mg/ml膠原酶ⅱ8ml，振蕩混勻，37℃下消化2h；

20、s1.2將s1.1消化后的麋鹿皮膚組織加入含10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的dmem完全培養(yǎng)基終止消化，1000rpm/5min離心收集細胞沉淀，用含100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的pbs清洗兩次之后添加含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素的完全培養(yǎng)基，將細胞接種到t25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d更換一次完全培養(yǎng)基；

21、s1.3當細胞匯合度達到80％時進行傳代，棄去原培養(yǎng)液，pbs清洗2次，加入0.2％胰蛋白酶消化細胞5min，加入dmem完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，以1000rpm/5min離心細胞懸液，收集細胞沉淀，添加dmem完全培養(yǎng)液混勻成細胞懸液，以1:3的比例進行傳代，利用胰酶消化5min，差速貼壁30min去除上皮細胞，留下成纖維細胞，獲得原代麋鹿皮膚成纖維細胞。

22、優(yōu)選的，

23、所述s5具體為：

24、將s2純化后處于對數(shù)生長期的原代麋鹿皮膚成纖維細胞用0.25％胰酶消化，1000rpm離心5min去上清，用培養(yǎng)基重懸，制成細胞懸液，接種，培養(yǎng)24h后，輕輕吸去培養(yǎng)基，小心加入1ml含5μg/ml?polybrene的培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，

25、加入s4獲得的含sv40t穩(wěn)定轉染慢病毒進行轉染，48h后更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉染細胞，每兩天更換一次培養(yǎng)基，待陰性對照細胞全部死亡后，將存活的細胞進行傳代繼續(xù)篩選，連續(xù)傳代20次后，獲得永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系。

26、優(yōu)選的，

27、利用免疫熒光檢測和western?blot技術檢測所述s5獲得的永生化麋鹿皮膚成纖維永生化細胞系中sv40t蛋白的表達情況，細胞增殖能力評估，細胞染色體核型分析與細胞周期檢測。

28、優(yōu)選的，

29、所述細胞染色體核型分析，具體為：

30、將所述永生化麋鹿皮膚成纖維細胞培養(yǎng)至第20代，用0.6μg/ml秋水仙素處理5h，8ml?0.5％kcl低滲液、無水甲醇：冰醋酸＝3:1的固定液固定后制成玻片，giemsa染液染色，在顯微鏡下觀察分析，確認所述s5獲得的永生化麋鹿皮膚成纖維細胞的染色體數(shù)目為68條。

31、采用上述任一項所述的一種永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系的制備方法制得的永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系(elaphurus?davidianus)，命名為ml-isfc，所述永生化麋鹿皮膚成纖維細胞保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏號是cgmccno.46327，保藏日期為2025年2月24日，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

32、本發(fā)明的有益效果是：

33、本發(fā)明提供的一種永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系的制備方法，免疫熒光染色和蛋白質印跡分析結果表明，成纖維細胞標志物波形蛋白(vimentin)在原代及永生化麋鹿皮膚成纖維細胞中均呈高表達，而上皮細胞標志物角蛋白18(krt18)在該細胞系中未檢測到表達，表明所構建的細胞系為純粹的成纖維細胞，無上皮細胞污染；利用免疫熒光與蛋白質印跡驗證了sv40t蛋白在經過多次傳代的永生化細胞系中穩(wěn)定表達，并且該細胞系的增殖速率顯著高于原代成纖維細胞，成功構建了永生化麋鹿皮膚成纖維細胞系，且具有較高的增殖能力，適用于基因功能研究與細胞培養(yǎng)相關的應用，填補了目前沒有針對麋鹿這一物種的永生化皮膚成纖維細胞這一空缺，實現(xiàn)了相關研究中作為實驗材料能夠即用即取，省去了每次需要時都要從組織中分離培養(yǎng)的繁瑣，穩(wěn)定的細胞狀態(tài)能夠保證實驗的可重復性，對遺傳學、病毒學、毒理學和流行病學等方面的研究提供試驗材料具有顯著的意義。