本發(fā)明屬于植物生物技術和基因工程，具體涉及茶樹csu3基因啟動子及其應用。

背景技術：

1、茶樹（ camellia?sinensis（l.）o.?kuntze）是一種多年生經(jīng)濟作物，茶樹的新梢可以制成茶葉，為人體提供多種有益營養(yǎng)，包括黃酮、生物堿和茶氨酸等，被超過三分之二的世界人口飲用，茶葉已成為世界上最受歡迎的健康、無酒精、消耗量僅次于水的飲品。茶樹具有基因組大、雜合度高、物種多樣性高等特點。而且，廣泛存在于茶樹種內、種間的雜交不親和性嚴重限制了茶樹雜交育種中親本的自由選配及優(yōu)異基因在育種中的利用，成為限制茶樹育種發(fā)展的瓶頸。目前，茶樹新材料的創(chuàng)制和新品種的選育主要是采用常規(guī)雜交、輻射誘變等育種方法，具有選育時間長、效率低、程序復雜的特征，因此迫切需要高效的技術手段來對茶樹進行遺傳改良。

2、基因編輯主要是利用序列特異核酸酶在特定基因位點產生dna雙鏈斷裂，從而激活細胞自身修復機制—非同源末端連接或同源重組來實現(xiàn)基因的敲除、定點插入、替換和染色體重組等，最終實現(xiàn)基因組序列的改變。基因編輯技術已經(jīng)在動物、植物和其他生物中得到了成功的應用，并在主要糧食及經(jīng)濟作物的精準育種方面發(fā)揮了重要的作用，在提高作物產量、品質、抗性等方面具有良好的應用前景。現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)主要包括鋅指核酸酶系統(tǒng)、類轉錄激活因子效應物核酸酶系統(tǒng)和crispr/cas系統(tǒng)等。其中crispr/cas系統(tǒng)由于載體構建過程簡單、編輯效率高等優(yōu)點，成為當前廣泛應用的基因編輯系統(tǒng)。目前主要使用的crispr/cas基因編輯體系主要包括crispr/cas9和crispr/cas12a系統(tǒng)等。crispr/cas9系統(tǒng)由grna（guide?rna）和cas9核酸內切酶構成，grna通過和靶序列的堿基配對結合到目標dna上，同時招募cas9蛋白，cas9蛋白與grna結合并識別靶序列下游的pam（protospacer?adjacent?motifs）位點，在pam上游約3?bp?處切割dna雙鏈，形成dna雙鏈斷裂，繼而引發(fā)生物體內源性的dna雙鏈斷裂修復。在dna雙鏈修復過程中會在雙鏈斷裂的位置引起若干堿基的插入或者缺失從而造成dna靶位點的基因編輯。

3、在基因編輯系統(tǒng)中，grna的表達由rna聚合酶ⅲ型啟動子u3或者u6驅動，目前在許多物種中u3、u6啟動子已有大量的報道，但是，對茶樹u3、u6啟動子的研究仍然缺乏。雖然u3、u6啟動子已在多個物種的基因編輯中成功運用，但同一啟動子在同源關系較遠的物種間并不一定適用，且同一物種基因中常存在多個u3或u6啟動子，其活性及轉錄效率存在一定差異。因此克隆出更多目標植物的內源u3、u6啟動子，有利于crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)的完善以及該技術在茶樹遺傳育種中的應用。因此，篩選出在茶樹中有功能活性的u3啟動子對于茶樹的基因育種技術發(fā)展具有積極的意義。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于涉及提供茶樹csu3基因啟動子及其應用的技術方案。

2、本發(fā)明具體采用以下技術方案實現(xiàn)：

3、本發(fā)明第一方面提供了茶樹csu3基因啟動子，其包括啟動子csu3a、csu3b、csu3c和csu3d，所述csu3a的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，csu3b的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，csu3c的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，csu3d的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

4、本發(fā)明第二方面提供了上述茶樹csu3基因啟動子在植物分子育種技術領域中的應用，所述的植物為茶樹或煙草。

5、本發(fā)明第三方面提供一種茶樹基因編輯載體，該載體含有上述茶樹csu3基因啟動子csu3a和csu3b。

6、進一步，所述茶樹基因編輯載體為puc19-crispr/cas9p35s-csu3a/csu3b-t7-cspdx2.1。

7、本發(fā)明第四方面提供了一種構建上述茶樹基因編輯載體的方法，該方法將上述茶樹csu3a和csu3b基因啟動子驅動grna表達。

8、本發(fā)明第五方面提供了一種對茶樹進行基因組編輯的方法，該方法將上述茶樹基因編輯載體導入茶樹原生質體中。

9、本發(fā)明第六方面提供了上述茶樹基因編輯載體在茶樹分子育種技術領域中的應用。

10、本發(fā)明第七方面提供了一種煙草基因編輯載體，該載體含有上述茶樹csu3a和csu3b基因啟動子。

11、進一步，所述煙草基因編輯載體為重組質粒pylcrispr/cas9p35s-h-csu3a/csu3b-sgrna-nbpds。

12、本發(fā)明第八方面提供了一種構建上述煙草茶樹基因編輯載體的方法，該方法將上述茶樹csu3a和csu3b基因啟動子驅動grna表達。

13、本發(fā)明第九方面提供了一種對煙草進行基因組編輯的方法，該方法將上述煙草基因編輯載體轉入煙草中。

14、本發(fā)明第十方面提供了上述煙草基因編輯載體在煙草分子育種技術領域中的應用。

15、本發(fā)明第十一方面提供一種克隆上述茶樹csu3啟動子的方法，該方法包含以下步驟：

16、（1）以茶樹品種‘龍井43’葉片基因組dna為模板，設計特異引物；

17、（2）使用高保真酶2×phanta?max?master?mix（dye?plus）在50μl體系中進行pcr反應，pcr擴增的反應體系為：1μl模板dna（50-400ng），2μl上游引物(10μm)，2μl下游引物(10μm)，25μl?2×phanta?max?master?mix(dye?plus)，20μl?ddh2o；

18、pcr擴增程序為：95℃預變性3min，95℃變性15s，53℃退火15s，72℃延伸30s，35個循環(huán)，70℃終延伸5min。

19、(3)將擴增產物通過bp反應克隆到pdonr221載體上，轉化大腸桿菌dh5α，挑取單克隆測序，即分別獲取包含茶樹csu3基因啟動子csu3a、csu3b、csu3c和csu3d序列的pdonr221載體。

20、進一步，該方法中針對啟動子csu3a的引物為csu3a-attb1和csu3a-attb2，所述csu3a-attb1的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，csu3a-attb2的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；針對啟動子csu3b的引物為csu3b-attb1和csu3b-attb2，所述csu3b-attb1的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，csu3b-attb2的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；針對啟動子csu3c的引物為csu3c-attb1和csu3c-attb2，所述csu3c-attb1的核苷酸序列如seq?idno.9所示，csu3c-attb2的核苷酸序列如seq?id?no.10所示；針對啟動子csu3d的引物為csu3d-attb1和csu3d-attb2，所述csu3d-attb1的核苷酸序列如seq?id?no.11所示，csu3d-attb2的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。

21、本發(fā)明第十二方面提供一種對上述茶樹csu3基因啟動子csu3a、csu3b、csu3c和csu3d的活性檢測的方法，該方法包含以下步驟：

22、（1）將csu3-pdonr221質粒通過lr反應連接到pmdc162載體上，轉化大腸桿菌dh5α，挑取單克隆測序，最終獲取csu3a-pmdc162、csu3b-pmdc162、csu3c-pmdc162和csu3d-pmdc162四種啟動子活性檢測載體。

23、（2）將得到的四種啟動子活性檢測載體分別轉化煙草，通過gus染色和定量檢測來比較四種csu3啟動子的轉錄活性。

24、本發(fā)明具有如下有益效果：將轉錄活性最高的兩個csu3啟動子csu3a和csu3b構建到基因編輯載體中，獲得茶樹內源u3基因啟動子驅動grna轉錄的基因編輯載體puc19-crispr/cas9p35s-csu3a/csu3b-t7-cspdx2.1，在茶樹原生質體中驗證了這一種啟動子應用于茶樹crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)的可行性，并實現(xiàn)了crispr/cas9介導的茶樹基因組靶向編輯。同時還獲得了茶樹csu3啟動子驅動grna轉錄的煙草基因編輯載體pylcrispr/cas9p35s-h-csu3a/csu3b-sgrna-nbpds，在煙草中也驗證了這一種啟動子應用于煙草crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)的可行性。因此，本發(fā)明克隆茶樹csu3基因啟動子不僅可以應用于茶樹基因編輯體系還能應用于煙草的基因組編輯，實現(xiàn)了對茶樹高效精準的種質創(chuàng)新與品種遺傳改良以及對煙草基因組的高效編輯。