本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種與tif1-γ蛋白特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著對(duì)特發(fā)性炎性肌?。╥diopathic?inflammatory?myopathy，iim）的研究，msas逐漸在iim患者的血清中檢測(cè)出來(lái)。msas包括抗氨基酰trna合成酶抗體（anti-aminoacyl-trna?synthetase，ars）、抗mi-2抗體、抗信號(hào)識(shí)別顆粒（anti-signal?recognitionparticles，srp）抗體、抗核基質(zhì)蛋白2（anti-nuclear?matrix?protein?2，nxp2）抗體、抗黑色素分化相關(guān)基因5（anti-melanoma?differentiation-associated?gene?5，mda5）抗體、抗轉(zhuǎn)錄中介因子（anti-transcription?intermediate?factor，tif）1-γ抗體、抗小泛素樣修飾活化酶（anti-small?ubiquitin-like?modified?activating?enzyme，sae）抗體等。其中抗tif1-γ抗體是2006年通過(guò)免疫沉淀法首次在肌炎患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種自身抗體，后續(xù)研究證實(shí)抗tif1-γ抗體可以作為預(yù)測(cè)dm合并惡性腫瘤的指標(biāo)。

2、tif1-γ又名trim33，是三重模體（tripartite?motif，trim）蛋白家族成員之一。trim的n端含有３個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括環(huán)指（ring?finger），b盒（b-box）和卷曲螺旋（coiledcoil）結(jié)構(gòu)域，也稱(chēng)rbcc家族，是e3泛素連接酶的環(huán)指家族的成員。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（tgf-β）信號(hào)通路被證實(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。tif1-γ是一種新的tgf-β信號(hào)通路調(diào)控因子，與腫瘤、炎癥和自身免疫疾病相關(guān)。tif1-γ可與磷酸化的smad2/smad3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合smad4，使活化的smad4分子單泛素化，并將smad4從細(xì)胞核中遷移至細(xì)胞質(zhì)，使其不能在核內(nèi)與其他分子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)控制癌細(xì)胞的增殖、代謝和轉(zhuǎn)移。部分研究報(bào)道dm患者（皮肌炎，dermatomyositis，dm）合并腫瘤的腺癌組織中p53過(guò)度表達(dá)，推測(cè)可能tif1-γ蛋白與腫瘤抑制基因p53相互作用有關(guān)。臨床研究還發(fā)現(xiàn)抗tif1-γ抗體陽(yáng)性者易出現(xiàn)向陽(yáng)疹、吞咽障礙，較少出現(xiàn)發(fā)熱、技工手、雷諾現(xiàn)象。因此，人tif1-γ重組蛋白不僅能夠?yàn)樵\斷dm提供可靠的手段，還可用于進(jìn)一步研究其在癌癥的發(fā)生過(guò)程中起到的作用。

3、檢測(cè)抗tif1-γ抗體的金標(biāo)準(zhǔn)是免疫沉淀法，該方法具有高度的特異性和可控性，可用于研究蛋白相互作用及結(jié)構(gòu)特性，但也存在獲得低豐度目標(biāo)蛋白、特異性差等缺點(diǎn)，因此在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)募夹g(shù)和方法，同時(shí)加強(qiáng)質(zhì)量控制和結(jié)果驗(yàn)證，才能提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，并不適用于臨床檢測(cè)。

4、目前臨床上檢測(cè)抗tif1-γ抗體最常用的是抗肌炎抗體譜igg檢測(cè)試劑盒（歐蒙印跡法）。免疫印跡法的優(yōu)點(diǎn)是多項(xiàng)聯(lián)檢，性價(jià)比高，非常符合國(guó)內(nèi)的臨床需求。缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間稍長(zhǎng)。大部分產(chǎn)品在室溫反應(yīng)，結(jié)果易受室溫變化影響，重復(fù)性一般。有些產(chǎn)品是目測(cè)判讀結(jié)果，人為誤差大。如果嚴(yán)格控制孵育溫度，可以有效提高重復(fù)性。但基于不同方法學(xué)之間特異性和敏感度，檢測(cè)結(jié)果缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)存在一定差異。因此，提供一種新的抗tif1-γ單克隆抗體對(duì)iim患者的疾病預(yù)判、預(yù)后評(píng)估和治療具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種與tif1-γ蛋白特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種高親和力結(jié)合tif1-γ蛋白的抗體，所述抗體能夠定量檢測(cè)dm患者中抗tif1-γ自身抗體水平，在dm的診斷中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種與tif1-γ蛋白特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)包括如seq?id?no:1所示的cdr1，如seq?id?no:2所示的cdr2，如seq?id?no:3所示的cdr3；

4、所述抗體或其抗原結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū)包括如seq?id?no:6所示的cdr1，cdr2的氨基酸序列為dds，如seq?id?no:7所示的cdr3。

5、本發(fā)明將人工合成的tif1-γ結(jié)構(gòu)域的基因重組到表達(dá)載體質(zhì)粒pet28b中，得到tif1-γ-pet28b表達(dá)載體。將tif1-γ-pet28b表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到bl21（de3）感受態(tài)中培養(yǎng)，純化得到tif1-γ抗原蛋白。

6、本發(fā)明以tif1-γ抗體陽(yáng)性患者pbmc構(gòu)建噬菌體人源抗體庫(kù)，通過(guò)與tif1-γ抗原蛋白特異性結(jié)合，從而篩選特異性抗原的抗體克隆。經(jīng)過(guò)三輪抗體噬菌體庫(kù)的篩選，將抗原組大于3倍對(duì)照組的克隆定為陽(yáng)性克隆，對(duì)這些單克隆進(jìn)行測(cè)序分析。排除掉錯(cuò)誤抗體序列和重復(fù)抗體序列，并結(jié)合elisa實(shí)驗(yàn)所反映的抗原抗體特異性結(jié)合能力，最終得到了一條高親和力的抗體，命名為tif1-γ-r7p1-g7。本發(fā)明篩選得到的抗體活性高、穩(wěn)定性好，且具有較強(qiáng)的特異性，能定量檢測(cè)dm患者中抗tif1-γ自身抗體水平。

7、優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:4所示；所述抗體或其抗原結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:8所示。

8、優(yōu)選地，所述抗體的重鏈的氨基酸序列如seq?id?no:5所示；所述抗體的輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no:9所示。

9、第二方面，本發(fā)明提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼第一方面所述的與tif1-γ蛋白特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。

10、優(yōu)選地，所述核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:10或seq?id?no:11所示。

11、第三方面，本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒載體，所述重組質(zhì)粒載體包括載體骨架和外源dna序列，所述外源dna序列包括第二方面所述的核酸分子。

12、第四方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)第一方面所述的與tif1-γ蛋白特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段的工程化細(xì)胞，所述工程化細(xì)胞中含有至少一個(gè)拷貝的第三方面所述的重組質(zhì)粒載體，或其基因組上整合了第二方面所述的核酸分子。

13、第五方面，本發(fā)明提供一種tif1-γ蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒，所述試劑盒包括第一方面所述的與tif1-γ蛋白特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。

14、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括酶標(biāo)板、酶標(biāo)記抗體、緩沖液、封閉液、標(biāo)準(zhǔn)品、顯色劑或終止劑中任意一種或至少兩種的組合

15、本發(fā)明中，所述試劑盒為國(guó)內(nèi)首個(gè)檢測(cè)抗tif1γ抗體的試劑盒，為tif1γ檢測(cè)提供新的方式，彌補(bǔ)了市場(chǎng)的空白；因該抗體與抗原特異性結(jié)合能力強(qiáng)，所以進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)時(shí)所需時(shí)間較短，節(jié)約時(shí)間。

16、第六方面，本發(fā)明提供第一方面所述的與tif1-γ蛋白特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段或第五方面所述tif1-γ蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒在制備用于診斷和/或檢測(cè)特發(fā)性炎性肌病的產(chǎn)品中的用途。

17、本發(fā)明中，所述與tif1-γ蛋白特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段在免疫組化、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光、免疫印跡、western-blot、免疫熒光等方法學(xué)中均能應(yīng)用，具有重要的應(yīng)用前景。

18、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

19、本發(fā)明篩選所得的抗體活性高、穩(wěn)定性好，且具有較強(qiáng)的特異性；將抗體置于37℃放置7天，其活性即與抗原的結(jié)合能力無(wú)顯著差異。特異性是指與抗原的特異性結(jié)合，通過(guò)elisa實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)判，od值越高，說(shuō)明結(jié)合能力越好。且通過(guò)稀釋抗體的濃度，od值與抗體濃度呈線性關(guān)系。高濃度的抗體可減少容器表面吸附造成的物質(zhì)損失。該抗體濃度大于0.5mg/ml，高于業(yè)內(nèi)水平。所述抗體還能定量檢測(cè)dm患者中抗tif1-γ自身抗體水平，在開(kāi)發(fā)檢測(cè)特發(fā)性炎性肌病的試劑盒中具有重要價(jià)值。