本發(fā)明涉及尿液檢測，尤其是涉及一種人尿中多種抗生素的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定法。

背景技術：

1、人類可以通過藥物、食物和飲水等途徑接觸抗生素。長期接觸低劑量抗生素會導致新的抗生素耐藥菌產(chǎn)生，并且接觸的抗生素可通過干擾腸道菌群而增加農(nóng)藥的生物利用度，并可能進一步增加農(nóng)藥暴露風險。此外，接觸抗生素會影響宿主菌群的組成和功能，可能增加肥胖、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和哮喘的風險。然而人群中抗生素暴露水平的數(shù)據(jù)尚不充分，這對抗生素暴露的健康風險評估造成了重要的阻礙。已有研究多使用藥物處方或問卷來測量抗生素的臨床暴露量，但忽略了從食物或環(huán)境中暴露抗生素的情況，因此會低估抗生素的真實暴露水平。也有一些研究評估了環(huán)境和食物中抗生素的暴露，但外暴露往往難以準確評估且無法真實反映人體的實際暴露水平。通過人體生物標志物可以分析來自所有途徑的化學物質(zhì)的實際內(nèi)暴露水平，這可能有助于改進風險評估。實驗發(fā)現(xiàn)，進入人體的抗生素會以不同的比例以原型或葡糖糖醛酸結合物形式隨尿液排出，而尿液樣本比血液或組織等其他生物材料更容易收集。所以，尿液抗生素殘留可能成為一種科學可行的暴露生物標志物。

2、目前為止，全球范圍內(nèi)尚無人尿中抗生素檢測的統(tǒng)一標準。雖然色譜法、免疫分析和電化學方法已被初步用于檢測人類尿液中的抗生素，但由于尿液成分復雜，基質(zhì)干擾較強，絕大多數(shù)方法可檢測的抗生素種類少，且操作復雜、檢測時間較長，難以滿足大規(guī)模人群的生物監(jiān)測需要。為此，建立一種能夠?qū)θ四蛑卸喾N痕量抗生素有效分離富集和定量檢測的高通量方法，并研究人群抗生素內(nèi)暴露特征，對于抗生素使用監(jiān)督和人群健康風險評估具有重要意義。

3、陳聰?shù)扔?011年發(fā)表在《法醫(yī)學雜志》上的一篇研究《超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定尿液中16種抗生素》，運用同位素內(nèi)標法定量，采用固相萃取(solid-phaseextraction，spe)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(hplc-ms/ms)的方法對尿液中16種抗生素進行分析。但該方法檢測的抗生素種類相對少，且均為β-內(nèi)酰胺類抗生素，未檢測其它類別的抗生素，特別是在人和動物中廣泛使用，且檢出率和檢出濃度較高的抗生素。因此，擴大待測目標物質(zhì)的種類具有十分重要的意義。此外，該方法前處理中未加入β-葡糖糖醛酸酶進行水解，忽略了結合物形式的抗生素，可能導致檢測結果偏低或漏檢。另外，該方法中抗生素的檢出限(limit?of?detection，lod)和定量極限(limit?of?quantification，loq)分別為0.05～10.0ng/ml，0.25～20.0ng/ml，大部分抗生素lod和loq相對較高，靈敏度不夠理想，無法滿足尿液中痕量抗生素的檢測要求，而提高檢測方法的靈敏度對于識別尿液中抗生素殘留和健康風險評估具有重要價值。

4、hexing?wang等于2014年發(fā)表在“anal?bioanal?chem”上的一篇研究“rapid?andsensitive?screening?and?selective?quantification?of?antibiotics?in?humanurine?by?two-dimensional?ultraperformance?liquid?chromatography?coupled?withquadrupole?time-of-flight?mass?spectrometry”，運用同位素內(nèi)標法定量，采用spe和uplc-ms/ms的方法對尿液中六大類14種抗生素進行分析。雖然該方法使用了96孔hlb固相萃取板，提高了前處理效率，但該方法僅對14種目標化合物進行了檢測研究，忽略了大部分人用、獸用和人獸共用抗生素，這些抗生素往往通過各種途徑被人體吸收，并且在本研究的樣本中被檢出；并且該方法的lod和loq范圍分別為0.04～1.99ng/ml和0.14～6.65ng/ml，lod和loq相對較高，靈敏度不夠理想。

5、專利公開號cn113466381b公開了一種固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定人體尿液中抗生素的方法，該方法主要將預處理的人體尿液樣品通過固相萃取處理后得到人體尿液濃縮樣品，再經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。但該方法中尿液平均ph約6.0，屬弱酸性，前處理中加入乙酸-乙酸銨緩沖液后導致樣本環(huán)境處于酸性狀態(tài)，很可能抑制某些物質(zhì)的電離或?qū)е虏糠只衔锼猓a(chǎn)生損失；且采用等度洗脫方式，不同化合物的溶解性，分離度和峰形較差。專利公開號cn114509520a公開了一種固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定人體尿液中抗生素的方法，通過固相萃取的前處理方法結合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的方法同時檢測人體尿液中五大類共18種抗生素藥物。首先將尿液樣本先解凍后離心得上清液，取上清液并加入edta-2na緩沖液，β-葡萄糖醛酸酶水溶液以及混合標準儲備液，過夜水解；再使用固相萃取小柱凈化、提取和富集尿液樣品中的18種目標待測物質(zhì)；然后利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為檢測平臺定性、定量檢測尿液中目標物質(zhì)，但該方法可檢測的抗生素種類少、檢測限較高。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種人尿中多種抗生素的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定法。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：

3、一種人尿中多種抗生素的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定法，包括以下步驟：

4、a1、尿液前處理：將混合內(nèi)標工作液、乙酸-乙酸銨緩沖溶液、羅曼蝸牛β-葡萄糖醛酸酶加入人類尿液樣品中，混勻后于水浴酶解；

5、a2、尿液富集凈化濃縮：將步驟a1得到的尿液通入使用甲醇、高純水、氫氧化鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液活化后的hlb固相萃取小柱中，再采用氫氧化鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液和高純水依次淋洗，并在真空條件下抽干，采用乙腈進行洗脫，洗脫液在水浴下弱氮吹至近干燥，再利用甲醇水溶液復容，渦旋振蕩后離心，得到人類尿液濃縮樣品；

6、a3、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra?performance?liquid?chromatography-tandem?mass?spectrometry，uplc-ms/ms)uplc-ms/ms檢測：將步驟a2得到的人類尿液濃縮樣品進行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測抗生素，所檢測的抗生素包括四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、恩諾沙星、達氟沙星、雙氟沙星、洛美沙星、阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素、替米考星、甲氧芐氨嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺甲嘧啶、乙?；前芳讗哼颉⒁阴；前芳奏奏ぁ⒙让顾?、甲砜霉素、氟苯尼考。

7、進一步地，在步驟a1中，所述的乙酸-乙酸銨緩沖溶液、羅曼蝸牛β-葡萄糖醛酸酶和人類尿液樣品的體積比為(200～400)：(15～25)：1。更進一步地，在步驟a1中，所述的乙酸-乙酸銨緩沖溶液與人類尿液樣品的體積比為(300～400)：1，優(yōu)選為400：1，適應所述羅曼蝸牛β-葡萄糖醛酸酶的最適ph。

8、進一步地，在步驟a1中，所述混合內(nèi)標工作液的濃度為50或100ug/l，乙酸-乙酸銨緩沖溶液的ph為4.4～4.6，羅曼蝸牛β-葡萄糖醛酸酶的酶活性大于等于100000units/ml。

9、進一步地，在步驟a1中，所述水浴酶解溫度為30～40℃，水浴酶解的時間為7～12h。更進一步地，所述水浴酶解的溫度為35～39℃，優(yōu)選為37℃。

10、進一步地，在步驟a2中，所述hlb固相萃取小柱與活化采用的甲醇、高純水、氫氧化鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液的體積比為3：(1～3)：(1～3)：(1～3)；更進一步地，所述hlb固相萃取小柱與活化采用的甲醇、高純水、氫氧化鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液的體積比為3：2：2：2。

11、進一步地，所述尿液通入活化后的hlb固相萃取小柱的流速為1～5ml/min。

12、進一步地，在步驟a2中，所述hlb固相萃取小柱與淋洗采用的氫氧化鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液、高純水的體積比為3：(1～2)：(1～2)。更進一步地，所述hlb固相萃取小柱與淋洗采用的氫氧化鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液、高純水的體積比為3∶1∶2。

13、進一步地，在步驟a2中，所述hlb固相萃取小柱與乙腈的體積比為3：(2～4)ml。更進一步地，在步驟a2中，所述hlb固相萃取小柱與乙腈的體積比為1：1ml。

14、進一步地，在步驟a2中，所述甲醇水溶液與人類尿液樣品的體積比為1：2或1：4，具體根據(jù)人類尿液樣品的濃縮倍數(shù)和溶解體積確定。

15、進一步地，在步驟a2中，所述水浴溫度為30～45℃，所述渦旋的轉(zhuǎn)速為1000～3000rpm所述離心的轉(zhuǎn)速為8000～12000rpm，離心的時間為2～5min，其目的為洗去雜質(zhì)。更進一步地，所述水浴溫度為35～39℃，優(yōu)選為37℃。

16、進一步地，在步驟a3中，uplc-ms/ms檢測中超高效液相色譜的參數(shù)為：色譜柱為t3色譜柱，100mm×2.1mm，1.8μm；流動相a為甲醇-乙腈溶液，流動相b為甲酸-水溶液，采用梯度洗脫方法；流速為0.5ml/min，柱溫為35℃，進樣量為10或15μl。

17、進一步地，所述甲醇-乙腈溶液中甲醇的體積濃度為35％～45％，甲酸-水溶液中甲酸的體積濃度為0.1％～0.3％。更進一步地，所述甲醇-乙腈溶液中甲醇的體積濃度為40％，甲酸-水溶液中甲酸的體積濃度為0.2％。

18、更進一步地，所述梯度洗脫方法的具體條件為：

19、0～1.0min，10％流動相a+90％流動相b；

20、1.0～7.0min，98％流動相a+2％流動相b；

21、7.0～9.5min，98％流動相a+2％流動相b；

22、9.5～9.8min，10％流動相a+90％流動相b；

23、9.8～11.5min，10％流動相a+90％流動相b。

24、進一步地，在步驟a3中，hplc-ms/ms檢測中質(zhì)譜的參數(shù)為：電離方式為電噴霧正離子源和電噴霧負離子源同時掃描，離子源電壓為4000～5000v，溫度為300～500℃，氣簾氣為20～40psi，噴霧氣為50～60psi，輔助加熱氣為50～60psi，監(jiān)測模式為多反應監(jiān)測模式。

25、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

26、(1)人類可以通過藥物使用、食物攝入、飲用水、生活環(huán)境等途徑接觸抗生素。既往研究發(fā)現(xiàn)，在人類尿液中共檢測到54種抗生素，以上25種抗生素中，絕大部分已報道具有較高的檢出率和檢出濃度，但在混合體系中物質(zhì)之間的相互作用會產(chǎn)生基質(zhì)效應，未能較好地消除或減弱基質(zhì)效應。此外，以上25中抗生素在人群調(diào)查和獸用抗生素名錄中使用頻率較高，以及對人群潛在的健康風險較大。本發(fā)明通過優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)、色譜條件及前處理方法，采用同位素內(nèi)標法，建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測人尿中四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、酚類和磺胺類共計25種抗生素殘留的方法，在樣本前處理、質(zhì)譜條件、方法驗證和實際樣本檢測等方面體現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢。

27、(2)本發(fā)明大幅度降低了檢測誤差，通過加入β-葡萄糖醛酸酶，將結合物形式的抗生素水解，酶解后的尿液樣本提高了殘留抗生素被檢出的機會，并且可以更準確地完成殘留抗生素的定性和定量評估，為發(fā)現(xiàn)更多的痕量抗生素殘留提供了技術支撐。

28、(3)在所有預處理過程中，需要考慮實驗條件，包括試劑的添加和樣品的ph。不適當?shù)臉悠穚h可能導致某些抗生素電離和降解，磺酰胺(堿性化合物)在酸性條件下容易電離；四環(huán)素在ph<2.0時不穩(wěn)定。尿液平均ph約6.0，屬弱酸性，前處理中加入乙酸-乙酸銨緩沖液后導致樣本環(huán)境處于酸性狀態(tài)，很可能抑制某些物質(zhì)的電離，或?qū)е虏糠只衔锼猓虼水a(chǎn)生了損失。而本發(fā)明在hlb固相萃取小柱活化和淋洗中加入了氫氧化鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液，使得ph增大，進一步增強了檢測物的電離，減少水解，從而提升檢出率。

29、(4)本發(fā)明采用uplc-ms/ms，有極高的靈敏度和檢測速率，這進一步提高了靈敏度和檢測效率，液相色譜體系中的流動相的選擇和混合比例對于目標化合物的電離有著重要影響，采用梯度洗脫可以根據(jù)化合物的異質(zhì)性盡可能的增強化合物的電離作用，改善峰強度和峰形，通過不斷優(yōu)化質(zhì)譜條件，在保證加標回收率穩(wěn)定的情況下，使五大類共計25種抗生素在一種方法內(nèi)全部檢出，使整個檢測方法的時間盡可能壓縮，最終在11.5分鐘內(nèi)可以完成25種抗生素物質(zhì)全部出峰，峰形圖質(zhì)量較高。

30、(5)本發(fā)明完成方法建立后進行驗證，25種抗生素在測定范圍內(nèi)線性關系良好，保證了回收率的穩(wěn)定，且每種目標物的檢出限較低，具有較高的準確度和較好的靈敏度。

31、(6)本發(fā)明在完成方法驗證后，進行了人群尿液樣本的檢測，該方法操作簡單，檢驗結果與同類研究類似，與實際情況相符，為大樣本量的快速檢測提供了更靈敏和便捷的技術方法，大大提高了實驗效率。