本發(fā)明涉及一種生物，較佳地，涉及一種釋放因子的去除方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(cell-free?protein?synthesis,cfps)是一種以外源mrna或dna為模板，在體外條件下的使用酶、氨基酸底物和能量來合成蛋白質(zhì)的技術(shù)。與傳統(tǒng)的體內(nèi)重組表達(dá)系統(tǒng)相比，體外無細(xì)胞合成系統(tǒng)具有多種優(yōu)點(diǎn)，如能夠直接以pcr產(chǎn)物作為模板同時(shí)平行合成多種蛋白質(zhì)，可開展高通量多肽或蛋白質(zhì)類藥物篩選，此外，體外無細(xì)胞合成系統(tǒng)在表達(dá)對細(xì)胞有毒害作用的多肽或蛋白質(zhì)的應(yīng)用方面也具有獨(dú)特優(yōu)勢。無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是基于細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的重要補(bǔ)充。

2、真核生物核糖體釋放因子erf1和erf3在蛋白質(zhì)翻譯的終止及重新釋放核糖體的過程中起到關(guān)鍵作用，其中erf1具有與trna類似的結(jié)構(gòu)，可以識(shí)別三種終止密碼子(uaa、uag、uga)；而erf3則具有與eef2類似的結(jié)構(gòu)，在erf1進(jìn)入核糖體和核糖體位移的過程中起到關(guān)鍵作用。這兩種核糖釋放因子的活性下降，會(huì)影響細(xì)胞中基于核糖體的蛋白質(zhì)合成終止過程。

3、在模式真菌釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)中存在兩個(gè)核糖體釋放因子編碼基因，分別被命名為sup45(erf1，ybr143c)和sup35(erf3，ydr172w)；在k.lactisy1140基因組中，這兩個(gè)基因?qū)?yīng)的基因編號依次為klla0_c11231g和klla0_d17424g。這兩個(gè)基因是必須基因，敲除會(huì)嚴(yán)重影響基因的細(xì)胞的生長。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是通過遺傳改造將細(xì)胞的釋放因子的末端引入標(biāo)簽蛋白，獲得的細(xì)胞裂解物有助于在體外去除釋放因子，從而無需將釋放因子的基因進(jìn)行敲除，不影響細(xì)胞的生長，且提高了非天然氨基酸插入蛋白質(zhì)的導(dǎo)入效率。

2、本發(fā)明第一方面提供一種核酸構(gòu)建物，其特征在于：所述核酸構(gòu)建物至少含有結(jié)構(gòu)如式i所述的核酸序列：z1-z2，式中，z1、z2分別為用于構(gòu)成所述構(gòu)建物的元件；“-”獨(dú)立地為鍵或核苷酸連接序列；z1為釋放因子的編碼序列，z2為標(biāo)簽蛋白的編碼序列，其中，式中未對z2的連接位置做限制，也即可以是在n端，也可以是在c端。

3、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的標(biāo)簽蛋白選自組氨酸標(biāo)簽、cbp標(biāo)簽、cmyc標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、spot標(biāo)簽、c標(biāo)簽、avi標(biāo)簽、streg標(biāo)簽、sumo標(biāo)簽、gst標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽或其組合。

4、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的標(biāo)簽選自組氨酸標(biāo)簽。

5、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述組氨酸標(biāo)簽結(jié)構(gòu)為n×his，其中1≦n≦50；優(yōu)選2≦n≦30；進(jìn)一步優(yōu)選地，5≦n≦20；更優(yōu)選6≦n≦10。

6、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述釋放因子為rf1、rf2或rf3。

7、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述釋放因子為erf1或erf3。

8、本發(fā)明第二方面提供一種重組釋放因子，所述重組釋放因子由本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物編碼得到。

9、進(jìn)一步優(yōu)選地，在編碼釋放因子的n-末端或c-末端引入標(biāo)簽蛋白。

10、進(jìn)一步優(yōu)選地，在erf1的c末端引入標(biāo)簽蛋白。

11、進(jìn)一步優(yōu)選地，在erf3的n末端引入標(biāo)簽蛋白。

12、本發(fā)明第三方面提供一種載體，所述載體中含有本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物。

13、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述載體選自：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、或動(dòng)物細(xì)胞載體、穿梭載體。此外，載體可以為轉(zhuǎn)座子載體。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。只要其能夠在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。

14、本發(fā)明第四方面提供一種基因工程菌株，所述基因工程菌株的基因組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)整合有本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物，或者所述基因工程菌株中含有本發(fā)明第二方面提供的重組蛋白或本發(fā)明第三方面提供的載體。

15、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的菌株來源于細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人體細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞之一或其任意組合。

16、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述酵母細(xì)胞選自畢赤酵母、芬蘭畢赤酵母(pichiafinlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(pichia?trehalophila)、科克拉馬畢赤酵母(pichiakoclamae)、膜醭畢赤酵母(pichia?membranaefaciens)、微小畢赤酵母(pichia?minuta)、甲醇誘導(dǎo)型酵母(ogataeaminuta)、林氏畢赤酵母(pichia?lindneri)、仙人掌畢赤酵母(pichia?opuntiae)、耐熱畢赤酵母(pichia?thermotolerans)、柳畢赤酵母(pichiasalictaria)、松櫟畢赤酵母(pichia?guercuum)、皮杰普畢赤酵母(pichia?pijperi)、樹干畢赤酵母(pichiastiptis)、甲醇畢赤酵母(pichia?methanolica)、畢赤酵母菌(pichiasp.)、釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)、啤酒酵母、甘蔗糖蜜酵母、酵母菌(saccharomyces?sp.)、多形漢遜酵母(hansenulapolymorpha)、產(chǎn)朊假絲酵母、克魯維酵母之一或其組合。

17、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的克魯維酵母進(jìn)一步包括：乳酸克魯維酵母(kluyveromyces，k.lactis)、馬克斯克魯維酵母(kluyveromyces?marxianus)、、多布克魯維酵母(kluyveromyces?dobzhanskii)、海泥克魯維酵母(kluyveromyces?aestuarii)、非發(fā)酵克魯維酵母(kluyveromyces?nonfermentans)、威克海姆克魯維酵母(kluyveromyceswickerhamii)、耐熱克魯維酵母(kluyveromyces?thermotolerans)、脆壁克魯維酵母(kluyveromyces?fragilis)、湖北克魯維酵母(kluyveromyces?hubeiensis)、多孢克魯維酵母(kluyveromyces?polysporus)、暹羅克魯維酵母(kluyveromyces?siamensis)、亞羅克魯維酵母(kluyveromyces?yarrowii)之一或其組合；較佳地，所述的酵母細(xì)胞為克魯維酵母細(xì)胞，更佳地為乳酸克魯維酵母細(xì)胞。

18、本發(fā)明第五方面提供一種體外去除釋放因子的方法，先將本發(fā)明第四方面提供的基因工程菌株制備成裂解液，然后將裂解液經(jīng)磁珠處理

19、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磁珠為鎳磁珠。

20、本發(fā)明第六方面提供一種體外反應(yīng)體系，通過本發(fā)明第五方面提供的一種體外去除釋放因子的方法得到。

21、進(jìn)一步優(yōu)選地，得到的體外反應(yīng)體系不含有或部分含有重組的釋放因子。

22、本發(fā)明第七方面提供一種用于合成非天然氨基酸摻入的蛋白質(zhì)的無細(xì)胞合成體系，包括：1)本發(fā)明第六方面提供的體外反應(yīng)體系；2)正交氨酰trna合成酶/正交trna對；3)非天然氨基酸；4)外源蛋白基因序列模板。

23、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述外源蛋白基因序列中的編碼氨基酸的至少一個(gè)密碼子被突變。

24、本發(fā)明第八方面提供一種本發(fā)明第六方面提供的無細(xì)胞合成體系在無細(xì)胞合成非天然氨基酸摻入的蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。

25、本發(fā)明第九方面提供一種試劑盒，所述的試劑盒包括本發(fā)明第六方面提供的無細(xì)胞合成體系。

26、本發(fā)明第十方面提供一種無細(xì)胞合成非天然氨基酸摻入的蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：步驟(1)，提供本發(fā)明第六方面提供的無細(xì)胞合成體系或本發(fā)明第九方面提供的試劑盒；步驟(2)，在步驟(1)所述的合成體系或試劑盒中加入編碼外源蛋白的dna分子，在正交氨酰trna合成酶/正交trna和非天然氨基酸存在的條件下，經(jīng)反應(yīng)得到所述的蛋白質(zhì)。

27、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述外源蛋白基因序列中的編碼氨基酸的至少一個(gè)密碼子被突變。

28、進(jìn)一步的，所述的外源蛋白選自：熒光素蛋白、熒光素酶(如螢火蟲熒光素酶)、熒光蛋白(如綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白)、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、過氧化氫酶、肌動(dòng)蛋白、抗體的可變區(qū)域、螢光素酶突變、α-淀粉酶、腸道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰島素前體、干擾素αa、細(xì)胞因子，干擾素α2b、白細(xì)胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、單鏈抗體段(scfv)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶或其組合。

29、進(jìn)一步的，所述的外源蛋白包括野生型蛋白、突變型蛋白或重組型蛋白。

30、進(jìn)一步的，所述的氨酰trna合成酶選自天然或突變的pyl-trna合成酶(pylrs)、leu-trna合成酶(leurs)、tyr-trna合成酶(tyrrs)、phe-trna合成酶(phers)或trp-trna合成酶(trprs)。進(jìn)一步優(yōu)選為pylrs。

31、進(jìn)一步的，所述的氨酰trna合成酶選自天然或突變的mapylrs、mmpylrs、mbpylrs、ectyrrs、mjtyrrs、ecleurs、scphers、sctrprs、bstrprs

32、進(jìn)一步的，所述的非天然氨基酸指的是20種天然氨基酸之外的氨基酸種類。

33、進(jìn)一步的，所述的非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)式為式(2)化合物或其鹽形式。

34、其中n選自1-20的自然數(shù)，r1選自取代或未取代的c5-c60的芳基或雜芳基、取代或未取代的c1-c20的烷基、取代或未取代的c2-c20的烯基或取代或未取代的c2-c20的炔基，a選自o或-ch2-。

35、在另一優(yōu)選例中，n選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

36、在另一優(yōu)選例中，n選自1-10的自然數(shù)。

37、在另一優(yōu)選例中，n選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

38、在另一優(yōu)選例中，n選自1-6的自然數(shù)。

39、在另一優(yōu)選例中，n選自1、2、3、4、5或6。

40、在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自取代或未取代的c5-c30的芳基或雜芳基。

41、在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自取代或未取代的苯基。

42、在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自取代或未取代的c2-c20的烯基。

43、在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自取代或未取代的c2-c10的烯基。

44、在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自取代或未取代的c2-c6的烯基。

45、在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自或取代或未取代的c2-c20的炔基。

46、在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自或取代或未取代的c2-c10的炔基。

47、在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自或取代或未取代的c2-c6的炔基。

48、在另一優(yōu)選例中，所述的a選自o。

49、在另一優(yōu)選例中，所述的a選自-ch2-。

50、在另一優(yōu)選例中，所述的取代基為本領(lǐng)域常見的取代基團(tuán)，如芳基、雜芳基、烷基、環(huán)烷基、芳基氧基、雜芳基氧基、烷基氧基、環(huán)烷基氧基、羥基、巰基、酯基、羧基、氰基、鹵素、硝基、磺酸基、疊氮基、烯基、炔基、磷酸基等。

51、在另一優(yōu)選例中，所述的非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)式選自如下的之一或組合，或其鹽形式：

52、

53、本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

54、(1)將編碼釋放因子的n-末端或c-末端引入了組氨酸標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)這種修飾能顯著降低了細(xì)胞提取物的體外蛋白質(zhì)合成活性，在核糖體展示及非天然氨基酸引入過程中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

55、(2)整合在菌株中的重組釋放因子，僅需通過簡單的體外吸附的方式去除，避免了通過常規(guī)的基因敲除方式對細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害的后果。

56、(3)經(jīng)體外去除重組釋放因子之后得到的反應(yīng)液，明顯提高了非天然氨基酸摻入的蛋白質(zhì)的體外合成的效率。