背景技術(shù)：

1、大規(guī)模平行深度測(cè)序也被稱為下一代測(cè)序(ngs)，其使得進(jìn)行大規(guī)模dna和rna測(cè)序成為可能。這些方法涉及大規(guī)模核酸序列的平行多重分析，從而允許來自單獨(dú)鏈的數(shù)百萬至數(shù)十億個(gè)序列被分別但同時(shí)分析。

2、多重分析可能是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)橥ǔ４治龅牟煌瑯悠分写嬖诘暮怂岬牧坎煌?，這可能產(chǎn)生低濃度樣品測(cè)序不足而高濃度樣品測(cè)序過度的不準(zhǔn)確性。因此，已經(jīng)采用了用于使樣品之間的核酸濃度歸一化的各種方法。已經(jīng)使用分光光度法、電泳法、熒光測(cè)定法和定量pcr(qpcr)來檢測(cè)樣品中核酸的濃度，以便使樣品之間的濃度歸一化。這些方法中的每種方法都具有缺點(diǎn)，如通過進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整引入的不準(zhǔn)確性、缺乏靈敏性和涉及大量時(shí)間和/或費(fèi)用的多個(gè)步驟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一些方面，本公開描述了用于使兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸測(cè)序文庫之間的多核苷酸濃度歸一化的方法和組合物。用于測(cè)序(例如，下一代測(cè)序(ngs))的多核苷酸制備通常涉及將銜接子多核苷酸序列添加到所述多核苷酸中。某些技術(shù)(如illumina測(cè)序)使用銜接子序列對(duì)多核苷酸進(jìn)行測(cè)序。本文認(rèn)識(shí)到，可以利用這些銜接子序列來使不同多核苷酸測(cè)序文庫之間的多核苷酸濃度歸一化。具體來說，認(rèn)識(shí)到多核苷酸測(cè)序文庫歸一化可以通過以下方式來實(shí)現(xiàn)：使多核苷酸測(cè)序文庫與預(yù)定量的核糖核蛋白(例如，催化失活的crispr相關(guān)蛋白(dcas)-向?qū)na(grna)復(fù)合物)接觸，所述核糖核蛋白與多核苷酸文庫的銜接子序列結(jié)合，并且提取(1)包含銜接子且(2)被所述核糖核蛋白復(fù)合物結(jié)合的多核苷酸。證明了對(duì)多個(gè)不同的多核苷酸測(cè)序文庫使用該方法使多核苷酸測(cè)序文庫之間的多核苷酸濃度歸一化。

2、因此，在一些方面，本公開提供了用于使至少兩個(gè)樣品之間的靶多核苷酸的濃度歸一化的方法，所述至少兩個(gè)樣品各自包含靶多核苷酸，對(duì)于所述至少兩個(gè)樣品中的每個(gè)樣品，所述方法包括：

3、(i)獲得所述樣品，其中所述樣品的所述靶多核苷酸包含銜接子序列；

4、(ii)產(chǎn)生溶液，所述產(chǎn)生包括合并(a)所述樣品，(b)預(yù)定濃度的向?qū)Ф嗪塑账?，所述向?qū)Ф嗪塑账岚c所述樣品的所述靶多核苷酸的所述銜接子序列互補(bǔ)的靶向區(qū)；和(c)預(yù)定濃度的dcas或dargonaute，所述dcas或所述dargonaute包含親和標(biāo)簽，其中所述預(yù)定濃度的所述dcas或所述dargonaute與所述向?qū)Ф嗪塑账嵬矗?/p>

5、(iii)使所述溶液與固相接觸，所述固相包含能夠與所述親和標(biāo)簽結(jié)合的親和標(biāo)簽結(jié)合分子；

6、(iv)將所述溶液與所述固相分離；以及

7、(v)從所述固相中提取所述靶多核苷酸，以使所述兩個(gè)或更多個(gè)樣品之間的靶多核苷酸的濃度歸一化。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與銜接子序列的靜態(tài)區(qū)互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账岚琧rispr相關(guān)蛋白(cas)向?qū)na(grna)多核苷酸或argonaute向?qū)Ф嗪塑账帷Ｔ谝恍?shí)施方式中，所述靜態(tài)區(qū)是下一代測(cè)序銜接子序列的靜態(tài)區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:27-36中任一所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:27-28中任一所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:29-30中任一所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:31-32中任一所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:33-34中任一所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:35所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:36所示的銜接子序列互補(bǔ)。

8、在一些實(shí)施方式中，所述cas?grna多核苷酸靶向區(qū)是同源區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述cas?grna多核苷酸包含seq?id?no:1-26中任一所示的同源區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述cas?grna多核苷酸包含seq?id?no:1所示的同源區(qū)。

9、在一些實(shí)施方式中，所述argonaute向?qū)Ф嗪塑账崾莝irna、mirna、pirna、shrna或sidna。

10、在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账崾莇na多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账崾莚na多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账岚?jīng)修飾的核酸。在一些實(shí)施方式中，所述經(jīng)修飾的核酸包含2'f?rna、2'ome?rna和/或硫代磷酸酯鍵(ps)。

11、在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账崾莄as?grna多核苷酸，并且所述cas?grna多核苷酸在與cas蛋白相互作用的位置不包含經(jīng)修飾的核酸，所述cas蛋白和所述grna同源。在一些實(shí)施方式中，所述dcas是催化失活的cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx或casy蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述dcas蛋白包含seq?id?no:37的氨基酸序列。

12、在一些實(shí)施方式中，所述dargonaute是催化失活的lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago。

13、在一些實(shí)施方式中，所述親和標(biāo)簽結(jié)合分子包含ni2+并且所述親和標(biāo)簽包含his標(biāo)簽。

14、在一些實(shí)施方式中，所述親和標(biāo)簽結(jié)合分子包含生物素并且所述親和標(biāo)簽包含親和素。在一些實(shí)施方式中，所述親和標(biāo)簽結(jié)合分子包含抗myc抗體并且所述親和標(biāo)簽包含myc標(biāo)簽。在一些實(shí)施方式中，所述親和標(biāo)簽和對(duì)應(yīng)的親和標(biāo)簽結(jié)合分子選自表1。

15、在一些實(shí)施方式中，所述固相包含磁珠。在一些實(shí)施方式中，將所述溶液與所述固相分離包括固定所述固相并洗滌所述固相。在一些實(shí)施方式中，從所述固相中提取所述靶多核苷酸包括合并所述固相和蛋白酶。在一些實(shí)施方式中，從所述固相中提取所述靶多核苷酸包括在足以產(chǎn)生蛋白酶k活性的溶液中合并所述固相和蛋白酶k。在一些實(shí)施方式中，蛋白酶k消化與所述固相結(jié)合的所述dcas或dargonaute，由此提取所述靶多核苷酸。

16、在一些實(shí)施方式中，步驟(i)-(v)是按先后順序進(jìn)行的。

17、在一些實(shí)施方式中，歸一化包括使所述至少兩個(gè)樣品之間的靶多核苷酸的濃度在歸一化之后在彼此的15％之內(nèi)。

18、在一些方面，本公開提供了一種用于使至少兩個(gè)樣品之間的靶多核苷酸的濃度歸一化的方法，所述至少兩個(gè)樣品各自包含靶多核苷酸，對(duì)于所述至少兩個(gè)樣品中的每個(gè)樣品，所述方法包括：

19、(i)獲得所述樣品，其中所述樣品的所述靶多核苷酸包含銜接子序列；

20、(ii)產(chǎn)生溶液，所述產(chǎn)生包括合并(a)所述樣品，(b)預(yù)定濃度的向?qū)Ф嗪塑账?，所述向?qū)Ф嗪塑账岚c所述樣品的所述靶多核苷酸的所述銜接子序列互補(bǔ)的靶向區(qū)，和(c)預(yù)定濃度的dcas或dargonaute，所述dcas或所述dargonaute包含親和標(biāo)簽；以及

21、(iii)使所述溶液與預(yù)定量的有催化活性的cas或argonaute蛋白接觸，以使所述兩個(gè)或更多個(gè)樣品之間的靶多核苷酸的濃度歸一化。

22、在一些實(shí)施方式中，所述dcas是催化失活的cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx、cas9或casy蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述dcas蛋白包含與seq?id?no:37具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述dcas蛋白包含seq?id?no:37的氨基酸序列。

23、在一些實(shí)施方式中，所述dargonaute是催化失活的lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago。

24、在一些實(shí)施方式中，步驟(ii)包括dcas或dargonaute與所述靶多核苷酸中的至少一些靶多核苷酸的所述銜接子序列的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述有催化活性的cas9或argonaute消化未被所述dcas9或所述dargonaute結(jié)合的靶多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，歸一化包括使所述至少兩個(gè)樣品之間的靶多核苷酸的濃度在歸一化之后在彼此的15％之內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，歸一化包括使所述至少兩個(gè)樣品之間的靶多核苷酸的濃度在歸一化之后在彼此的10％之內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，所述靶多核苷酸包含第一銜接子序列和第二銜接子序列，并且其中所述向?qū)Ф嗪塑账岚邢騾^(qū)與所述第一銜接子序列互補(bǔ)。

25、在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括，在步驟(i)之后且在步驟(ii)之前進(jìn)行以下操作：

26、(a)使所述樣品與編碼與所述第二銜接子序列的一部分互補(bǔ)的核酸序列的引物接觸，其中所述銜接子序列的所述部分位于所述銜接子序列的近端部分；以及

27、(b)使所述樣品與dna聚合酶在足以促進(jìn)引物延伸的條件下接觸。

28、在一些實(shí)施方式中，所述銜接子序列的所述部分包含seq?id?no:28、30、32和34中的任一者的核酸序列。

29、在一些實(shí)施方式中，所述第二銜接子序列是3'銜接子序列。在一些實(shí)施方式中，所述第二銜接子序列是5'銜接子序列。

30、在一些方面，本公開提供了一種向?qū)Ф嗪塑账?，所述向?qū)Ф嗪塑账岚邢騾^(qū)，所述靶向區(qū)與seq?id?no:28和30、32、34-36中任一所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账岚琧rispr相關(guān)蛋白(cas)向?qū)na(grna)多核苷酸或argonaute向?qū)Ф嗪塑账帷?/p>

31、在一些實(shí)施方式中，所述靜態(tài)區(qū)是下一代測(cè)序銜接子序列的靜態(tài)區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:28所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:30所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:32所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:34所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:35所示的銜接子序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:36所示的銜接子序列互補(bǔ)。

32、在一些實(shí)施方式中，所述cas?grna多核苷酸靶向區(qū)是同源區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述cas?grna多核苷酸包含seq?id?no:1-26中任一所示的同源區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述cas?grna多核苷酸包含seq?id?no:1所示的同源區(qū)。

33、在一些實(shí)施方式中，所述argonaute向?qū)Ф嗪塑账崾莝irna、mirna、pirna、shrna或sidna。

34、在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账崾莇na多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账崾莚na多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账岚?jīng)修飾的核酸。在一些實(shí)施方式中，所述經(jīng)修飾的核酸包含2'f?rna、2'ome?rna和/或硫代磷酸酯鍵(ps)。在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账崾莄as?grna多核苷酸，并且所述cas?grna多核苷酸在與cas蛋白相互作用的位置不包含經(jīng)修飾的核酸，所述cas蛋白和所述grna同源。

35、在一些實(shí)施方式中，本公開在本文中提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含(a)本文所述的向?qū)Ф嗪塑账?，?b)cas蛋白或argonaute蛋白、或編碼cas蛋白或argonaute蛋白的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述cas蛋白是催化失活的cas蛋白(dcas)。在一些實(shí)施方式中，所述cas蛋白是催化失活的cas9蛋白(dcas9)。在一些實(shí)施方式中，所述cas9蛋白包含d10a突變和h840a突變。在一些實(shí)施方式中，所述cas蛋白是催化失活的cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx或casy蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述dcas蛋白包含與seq?id?no:37具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述dcas蛋白包含seq?id?no:37的氨基酸序列。

36、在一些實(shí)施方式中，所述argonaute蛋白是催化失活的(dargonaute)。在一些實(shí)施方式中，所述argonaute蛋白是催化失活的cbago蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述argonaute蛋白是催化失活的lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述dargonaute蛋白包含與seq?id?no:39-45中的任一者具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述dargonaute蛋白包含seq?id?no:39-45中的任一者的氨基酸序列。

37、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含有催化活性的cas蛋白或有催化活性的argonaute蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述有催化活性的cas蛋白包含cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx、cas9或casy。在一些實(shí)施方式中，所述有催化活性的argonaute蛋白包含lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago。在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账崮軌蚺c所述cas蛋白或所述argonaute蛋白結(jié)合以形成核糖核蛋白復(fù)合物，并且所述核糖核蛋白復(fù)合物能夠與銜接子序列結(jié)合。

38、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含與銜接子序列的一部分互補(bǔ)的引物。在一些實(shí)施方式中，所述銜接子序列的所述部分位于所述銜接子序列的近端部分中。在一些實(shí)施方式中，所述銜接子序列的所述部分位于所述銜接子序列的所述近端部分中，所述銜接子序列包含seq?id?no:28、30、32和34中的任一者的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述銜接子序列是3'銜接子序列。在一些實(shí)施方式中，所述銜接子序列是5'銜接子序列。在一些實(shí)施方式中，所述引物不與銜接子序列互補(bǔ)，所述銜接子序列和所述向?qū)Ф嗪塑账岚邢騾^(qū)互補(bǔ)。

39、在一些方面，本公開提供了一種反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：(i)多個(gè)靶多核苷酸，其中所述靶多核苷酸包含seq?id?no:28、30、32和34-36中任一所示的銜接子序列；(ii)預(yù)定濃度的向?qū)Ф嗪塑账?，所述向?qū)Ф嗪塑账岚c所述銜接子序列互補(bǔ)的靶向區(qū)；以及(iii)預(yù)定濃度的dcas蛋白或dargonaute蛋白。

40、在一些實(shí)施方式中，所述向?qū)Ф嗪塑账峄蛩鰀cas蛋白或所述dargonaute蛋白的所述預(yù)定濃度低于所述反應(yīng)混合物中靶多核苷酸的濃度。

41、在一些實(shí)施方式中，所述dargonaute蛋白包含lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago或其催化失活的變體，并且所述向?qū)Ф嗪塑账崤c所述dargonaute蛋白同源。在一些實(shí)施方式中，所述dcas蛋白包含催化失活的cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx、cas9或casy或其變體，并且所述向?qū)Ф嗪塑账崤c所述dcas蛋白同源。在一些實(shí)施方式中，所述銜接子序列包含seq?id?no:28、30、32和34-36中的任一者的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含催化活性的cas蛋白或催化活性的argonaute蛋白。

42、在一些實(shí)施方式中，本公開提供了一種核糖核蛋白(rnp)復(fù)合物，所述rnp復(fù)合物包含：(i)本文所述的向?qū)Ф嗪塑账幔?ii)cas蛋白或argonaute蛋白，所述cas蛋白或所述argonaute蛋白與所述向?qū)Ф嗪塑账嵬矗灰约?iii)銜接子序列，其中所述向?qū)Ф嗪塑账岬陌邢騾^(qū)與所述銜接子序列互補(bǔ)，并且其中所述向?qū)Ф嗪塑账崤c所述cas蛋白或所述argonaute蛋白同源。在一些實(shí)施方式中，所述argonaute蛋白包含lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago或其催化失活的變體。在一些實(shí)施方式中，所述cas蛋白包含cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx、cas9或casy或其催化失活的變體。在一些實(shí)施方式中，所述銜接子序列包含seq?id?no:28、30、32和34-36中的任一者的多核苷酸序列。