本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、轉(zhuǎn)座子整合技術(shù)是編輯工程菌基因組的常用方法之一，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，兩端帶有特定識別序列的目的基因可以被插入到宿主基因組中，實現(xiàn)基因的穩(wěn)定整合。該技術(shù)在基因功能研究、轉(zhuǎn)基因生物構(gòu)建以及基因治療等諸多領(lǐng)域都發(fā)揮著重要的作用。通常轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)通過抗性篩選標(biāo)簽篩選目的基因整合的菌株，而抗生素抗性基因殘留會增加宿主的代謝負擔(dān)、帶來抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移的隱患，同時限制工程菌在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。
2、因此如何使轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)擺脫抗性篩選標(biāo)簽的限制還有待研究。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)及其應(yīng)用。該轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)利用ptxd篩選標(biāo)簽，可以實現(xiàn)無抗生素抗性基因殘留的基因整合。
2、為此，在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提出了一種無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，該轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為單質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)或雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)；
3、所述單質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)包括表達轉(zhuǎn)座酶、并攜帶報告基因和ptxd基因的第一質(zhì)粒；
4、所述雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)包括表達轉(zhuǎn)座酶的第二質(zhì)粒和攜帶報告基因和ptxd基因的第三質(zhì)粒。
5、根據(jù)本發(fā)明的一種無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，亞磷酸氧化還原酶(phosphite?oxidoreductase，ptxd)由ptxd基因編碼，該酶可以將亞磷酸鹽(phosphite,phi)轉(zhuǎn)化為磷酸鹽(phosphate,pi)；將ptxd基因作為轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的篩選標(biāo)簽，外源表達ptxd基因的菌株可以轉(zhuǎn)化亞磷酸鹽，結(jié)合亞磷酸鹽作為唯一磷源的培養(yǎng)基即可獲得無抗性篩選標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)編輯菌株，避免抗生素抗性基因殘留，從而可將轉(zhuǎn)座系統(tǒng)應(yīng)用于腸道益生菌中，減少對腸道菌群的影響。
6、另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例提出無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：
7、可選地，所述報告基因為綠色熒光蛋白egfp基因，可在egfp后添加其他生產(chǎn)模塊，以更高效的獲得生產(chǎn)菌株。
8、可選地，所述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為非復(fù)制型tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。其中，轉(zhuǎn)座系統(tǒng)也可以是himar1、piggybac等。
9、可選地，將核苷酸序列如seq?id?no:1所示的pkd3-cm-tn5載體通過notⅰ-xhoⅰ切割，與notⅰ-xhoⅰ切割后的核苷酸序列如seq?id?no:2所示的報告基因和ptxd基因模塊pcon-egfp-ptxd連接，獲得pkd3-cm-tn5-pcon-egfp-ptxd-tn5質(zhì)粒，即為所述第三質(zhì)粒；
10、將pkd3-cm-tn5-pcon-egfp-ptxd-tn5質(zhì)粒通過xbaⅰ切割，與xbaⅰ切割后的核苷酸序列如seq?id?no:5所示的轉(zhuǎn)座酶基因模塊pteta-tnp*連接，獲得pkd3-cm-pteta-tnp*-tn5-pcon-egfp-ptxd-tn5質(zhì)粒，即為所述第一質(zhì)粒。
11、可選地，將核苷酸序列如seq?id?no:3所示的psc101載體通過ecorⅰ-salⅰ切割，與ecorⅰ-salⅰ切割后的核苷酸序列如seq?id?no:4所示的轉(zhuǎn)座酶基因模塊pteta-tnp連接，獲得psc101-tnp質(zhì)粒，即為所述第一質(zhì)粒。
12、在本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明提出了利用上述無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)編輯菌株的方法，包括：
13、將所述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)隨機整合至目標(biāo)宿主的基因組；
14、將所述目標(biāo)宿主在以亞磷酸鹽為唯一磷源的平板上篩選可以正常生長的菌落，得到基因整合成功的菌株，同時報告基因的輸出強度作為目的基因表達量的指標(biāo)，用于判斷整合效果。
15、根據(jù)本發(fā)明的一種利用上述無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)編輯菌株的方法，將ptxd基因作為轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的篩選標(biāo)簽，在以亞磷酸鹽為唯一磷源的篩選壓力下，能夠快速獲得無抗性的轉(zhuǎn)座菌株；相較于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)而言，由于抗性標(biāo)簽的限制，大多數(shù)轉(zhuǎn)座無法實際應(yīng)用于后續(xù)的腸道治療或生產(chǎn)實踐應(yīng)用中。因此，利用無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)編輯菌株的方法在實際應(yīng)用中更具競爭力。
16、可選地，所述目標(biāo)宿主為大腸桿菌nissle?1917，也可以是其他底盤細胞。
17、可選地，將所述第一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌nissle?1917感受態(tài)細胞，在以亞磷酸鹽為唯一磷源的平板上篩選正常生長的菌株，隨機挑取菌落，檢測綠色熒光，判斷所述單質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的基因整合效果；
18、或是，將所述第二質(zhì)粒轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入所述大腸桿菌nissle?1917感受態(tài)細胞，獲得表達轉(zhuǎn)座酶的菌株；將所述第三質(zhì)粒轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入所述表達轉(zhuǎn)座酶的菌株，在以亞磷酸鹽為唯一磷源的平板上篩選正常生長的菌株，隨機挑取菌落，檢測綠色熒光，判斷所述雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的基因整合效果。
19、該方法將ptxd基因作為轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的篩選標(biāo)簽，利用以亞磷酸鹽為唯一磷源的培養(yǎng)基篩選得到轉(zhuǎn)座子隨機基因整合的菌株，同時報告基因的輸出強度作為目的基因表達量的指標(biāo)，用于判斷整合效果；由于質(zhì)粒在后續(xù)步驟移除，因此該轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)改造的菌株不帶任何抗性篩選標(biāo)簽，從而消除在下游應(yīng)用方面的安全隱患和抗性基因帶來的代謝負擔(dān)。
20、在本發(fā)明的第三個方面，本發(fā)明提出上述的方法得到無抗性篩選標(biāo)簽殘留的改造菌株。
21、在本發(fā)明的第四個方面，本發(fā)明提出上述的無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)或上述的方法在改造腸道益生菌中的應(yīng)用。
22、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
1.一種無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為單質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)或雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)；
2.如權(quán)利要求1所述的無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述報告基因為綠色熒光蛋白egfp基因。
3.如權(quán)利要求1所述的無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為非復(fù)制型tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。
4.如權(quán)利要求1所述的無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，將核苷酸序列如seq?id?no:1所示的pkd3-cm-tn5載體通過notⅰ-xhoⅰ切割，與notⅰ-xhoⅰ切割后的核苷酸序列如seq?id?no:2所示的報告基因和ptxd基因模塊pcon-egfp-ptxd連接，獲得pkd3-cm-tn5-pcon-egfp-ptxd-tn5質(zhì)粒，即為所述第三質(zhì)粒；
5.如權(quán)利要求1所述的無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，將核苷酸序列如seq?id?no:3所示的psc101載體通過ecorⅰ-salⅰ切割，與ecorⅰ-salⅰ切割后的核苷酸序列如seq?id?no:4所示的轉(zhuǎn)座酶基因模塊pteta-tnp連接，獲得psc101-tnp質(zhì)粒，即為所述第一質(zhì)粒。
6.一種利用權(quán)利要求1-5中任一項所述的無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)編輯菌株的方法，其特征在于，包括：
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)宿主為大腸桿菌nissle?1917。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將所述第一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌nissle1917感受態(tài)細胞，在以亞磷酸鹽為唯一磷源的平板上篩選正常生長的菌株，隨機挑取菌落，檢測綠色熒光，判斷所述單質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的基因整合效果；
9.如權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法得到無抗性篩選標(biāo)簽殘留的改造菌株。
10.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的無抗性篩選標(biāo)簽殘留的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)或權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法在改造腸道益生菌中的應(yīng)用。