本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及單質(zhì)粒一步法基因組高效編輯技術(shù)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、噬菌體(bacteriophage?or?phage)是寄生在細菌、古細菌等原核生物體內(nèi)的病毒，特異性感染和殺死細菌。細菌耐藥性危機的出現(xiàn)重燃了人們使用噬菌體作為抗菌劑的興趣。但是使用某些天然噬菌體作為抗菌劑具有潛在的局限性，如果噬菌體呈溶原性，則其多數(shù)會整合到宿主染色體上進入休眠狀態(tài)而無法達到理想抗菌效果；或者一些天然噬菌體的細菌宿主范圍較窄。因此，需要設(shè)計治療特性、安全功能和宿主范圍等方面增強的工程噬菌體。傳統(tǒng)的噬菌體基因編輯方法包括隨機誘變和同源重組，往往效率較低、操作費時費力，極大的限制了噬菌體的相關(guān)研究。近幾年，研究人員將crispr-cas系統(tǒng)作為負向篩選標記應(yīng)用于噬菌體基因組編輯技術(shù)，提高了噬菌體基因組的編輯效率。
2、crispr-cas是細菌和古細菌在長期的進化過程中形成的一種對抗噬菌體感染或外源dna入侵的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)。基于crispr-cas系統(tǒng)的基因編輯方法利用cas-crrna復(fù)合物靶向基因組特異性位點產(chǎn)生雙鏈斷裂切口，再通過同源重組與攜帶同源片段的供體質(zhì)粒交換片段，從而得到符合預(yù)期的重組噬菌體。目前，crispr-cas系統(tǒng)已被用于多種細菌或噬菌體的基因組編輯，例如woudstra?c等人將pcas/ptargetf雙質(zhì)粒系統(tǒng)用于沙門氏菌噬菌體的基因組編輯；chen?y等人證明基于fncas12a的雙質(zhì)粒系統(tǒng)可用于沙門氏菌噬菌體基因編輯。對比傳統(tǒng)的同源重組編輯方法，基于crispr系統(tǒng)的雙質(zhì)粒噬菌體編輯方法顯著提高了噬菌體基因組的編輯效率。但雙質(zhì)粒系統(tǒng)通常涉及多種抗生素抗性基因的使用、涉及誘導劑的使用以及多次轉(zhuǎn)化宿主細菌，操作過程較為費時費力，尤其對于天然轉(zhuǎn)化效率較低的宿主細菌。
3、申請人在前期的工作中，使用已報道的pcas/ptargetf雙質(zhì)粒系統(tǒng)和cas9/puc19雙質(zhì)粒系統(tǒng)在沙門氏菌中進行功能性驗證，發(fā)現(xiàn)存在沙門氏菌轉(zhuǎn)化效率很低的情況，這一情況限制了基因組編輯的進程，使得整個編輯流程較為費時。
4、目前，缺乏便捷、經(jīng)濟且高效的沙門氏菌噬菌體編輯方法，并且關(guān)于沙門氏菌噬菌體的基因組編輯的研究很少。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供單質(zhì)粒一步法噬菌體或細菌的高效基因編輯方法，所述編輯載體lpe274的序列為seq?id?no.1所示。
2、本發(fā)明的另一個目的在于提供單質(zhì)粒一步法噬菌體或細菌的高效基因編輯方法的應(yīng)用。為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
3、單質(zhì)粒一步法噬菌體或細菌的高效基因編輯方法，其方法包括：
4、當編輯對象為細菌時，是以載體lpe274為基礎(chǔ)，構(gòu)建待編輯細菌基因的編輯載體，然后轉(zhuǎn)化進細菌，篩選陽性轉(zhuǎn)化子；
5、當編輯對象為噬菌體時，是以載體lpe274為基礎(chǔ)，構(gòu)建待編輯噬菌體基因的編輯載體，然后轉(zhuǎn)化進噬菌體宿主菌，之后用待編輯噬菌體侵染，挑取噬菌斑，篩選陽性重組噬菌體；
6、所述載體lpe274的序列為seq?id?no.1所示。
7、以上所述的方法，優(yōu)選的，所述的噬菌體為以沙門氏菌為宿主的噬菌體；
8、以上所述的方法，優(yōu)選的，所述的細菌為沙門氏菌。
9、上述方法在噬菌體或細菌的高效基因編輯中的應(yīng)用。
10、以上所述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的噬菌體為以沙門氏菌為宿主的；
11、以上所述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的細菌為沙門氏菌。
12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：
13、(1)本發(fā)明構(gòu)建了一種新型單質(zhì)粒一步法沙門氏菌噬菌體基因組編輯系統(tǒng)，利用單個質(zhì)粒同時實現(xiàn)供體質(zhì)粒和靶向質(zhì)粒的功能。該質(zhì)粒在沙門氏菌中的轉(zhuǎn)化率極高，完全克服了目前沙門氏菌轉(zhuǎn)化率低，需要反復(fù)操作的問題，為后期噬菌體的基因編輯打下良好基礎(chǔ)。
14、(2)本發(fā)明的方法減少抗生素抗性基因的使用，提高低盤細菌適用范圍，無需誘導劑和避免多次宿主菌轉(zhuǎn)化過程，即可實現(xiàn)高效的基因編輯，極大減少了基因編輯操作的時間和成本。
15、(3)本發(fā)明提供的編輯載體，對以沙門氏菌為宿主的噬菌體的編輯效率高于99％。
16、(4)本申請僅使用單個質(zhì)粒同時表達crispr-cas復(fù)合物和提供同源重組模板，單質(zhì)粒編輯系統(tǒng)相對于雙質(zhì)粒編輯系統(tǒng)構(gòu)建周期更短，可以節(jié)省時間，使得編輯過程更加快速、簡便。
1.單質(zhì)粒一步法噬菌體或細菌的高效基因編輯方法，其方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的噬菌體為以腸桿菌為宿主的噬菌體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的細菌為腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的噬菌體為以沙門氏菌為宿主的噬菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的細菌為沙門氏菌。
6.權(quán)利要求1所述的方法在噬菌體或細菌的高效基因編輯中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的噬菌體為以腸桿菌為宿主的噬菌體。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的細菌為腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的噬菌體為以沙門氏菌為宿主的噬菌體。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的細菌為沙門氏菌。