本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種表達(dá)lpl的重組載體、重組菌和lpl生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
1、脂肪酶，是一類重要的工業(yè)水解酶，可以催化水解多種形式的長鏈三酰基甘油酯，形成脂肪酸和甘油。脂肪酶在油水界面能夠催化水解油脂，在微水相和非水相中也能發(fā)生酯化反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)、交酯反應(yīng)、酸解反應(yīng)等比較復(fù)雜的催化反應(yīng)，所以脂肪酶被認(rèn)為是目前生物領(lǐng)域中最為重要的催化劑之一，在食品、洗滌、飼料和生物柴油等方面都具有很大的商業(yè)價值。
2、和普通脂肪酶不一樣，來源于假單胞菌脂蛋白脂肪酶(lipoprotein?lipase)，是一種特殊的甘油三酯蛋白水解酶，它能夠水解體內(nèi)乳糜微粒和其他低密度脂蛋白中的甘油三酯。在臨床診斷醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，脂蛋白脂肪酶廣泛用于血清或其他樣本中甘油三酯的定量。
3、然而脂蛋白脂肪酶的大量活性表達(dá)一直是困擾行業(yè)的難題，常規(guī)育種、發(fā)酵條件優(yōu)化、異源表達(dá)等策略均不能從根本上提高其產(chǎn)量。其原因主要有兩點：其一，常見的模式宿主細(xì)胞常常沒有與脂蛋白脂肪酶相對應(yīng)的同源分泌系統(tǒng)，大量表達(dá)的酶容易對宿主細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性而過早死亡，或者多表達(dá)為包涵體(避免毒害宿主細(xì)胞)，需經(jīng)復(fù)雜、繁瑣的復(fù)性步驟，才能得到折疊不佳和酶活力不高的酶蛋白；其二，脂蛋白脂肪酶基因擁有同源折疊酶基因，需要在同源折疊酶的作用下才能形成正確構(gòu)象的活性蛋白質(zhì)，而異源宿主細(xì)胞常常沒有對應(yīng)的折疊酶。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供了一種表達(dá)lpl的重組載體、重組菌和lpl生產(chǎn)方法，以銅綠假單胞菌為表達(dá)細(xì)胞，可顯著提高lpl的表達(dá)量及酶活。
2、本發(fā)明提供了一種表達(dá)銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的重組載體，所述銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
3、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述重組載體的基礎(chǔ)載體包含lac啟動子。
4、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述重組載體的基礎(chǔ)載體包含穿梭載體pbbr1mcs-5。
5、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述重組載體中，銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的編碼基因插入所述基礎(chǔ)載體的hindiii和bamhi之間。
6、本發(fā)明還提供了一種包含上述重組載體并表達(dá)銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的重組銅綠假單胞菌。
7、本發(fā)明還提供了上述重組銅綠假單胞菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：將銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的編碼基因插入穿梭載體pbbr1mcs-5中，構(gòu)建重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌宿主菌中，構(gòu)建得到所述重組銅綠假單胞菌。
8、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述編碼基因在擴(kuò)增時，以銅綠假單胞菌(pseudomonas?aeruginosa)pao1為模板，利用核苷酸序列如seq?id?no.3所示的上游引物和seq?id?no.4所示的下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。
9、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述銅綠假單胞菌宿主菌包括銅綠假單胞菌pao1。
10、本發(fā)明還提供了一種銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的生產(chǎn)方法，包括對所述重組銅綠假單胞菌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中包含所述銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶；
11、所述重組銅綠假單胞菌包括上述重組銅綠假單胞菌或利用上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的重組銅綠假單胞菌。
12、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，在得到所述培養(yǎng)液后，還包括離子交換層析純化。
13、有益效果：本發(fā)明提供了一種銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶(lipoprotein?lipase，lpl)的重組表達(dá)載體，其中l(wèi)pl編碼基因來源于銅綠假單胞菌。本發(fā)明將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入銅綠假單胞菌pao1細(xì)胞，成功構(gòu)建表達(dá)菌株，提高了目的蛋白的表達(dá)量，實現(xiàn)了lpl在pao1中的高效表達(dá)。
14、本發(fā)明實施例中，選擇銅綠假單胞菌(pseudomonas?aeruginosa)pao1作為同源表達(dá)的宿主菌，將lpl基因序列構(gòu)建到表達(dá)載體pbbr1mcs-5中，實現(xiàn)了lpl在銅綠假單胞菌pao1中的高效表達(dá)，且生產(chǎn)得到的lpl酶活高，應(yīng)用范圍更廣。
1.一種表達(dá)銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的重組載體，其特征在于，所述銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組載體，其特征在于，所述重組載體的基礎(chǔ)載體包含lac啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述重組載體，其特征在于，所述重組載體的基礎(chǔ)載體包含穿梭載體pbbr1mcs-5。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述重組載體，其特征在于，所述重組載體中，銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的編碼基因插入所述基礎(chǔ)載體的hindiii和bamhi之間。
5.一種包含權(quán)利要求1～4任一項所述重組載體并表達(dá)銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的重組銅綠假單胞菌。
6.權(quán)利要求5所述重組銅綠假單胞菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：將銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的編碼基因插入穿梭載體pbbr1mcs-5中，構(gòu)建重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌宿主菌中，構(gòu)建得到所述重組銅綠假單胞菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述編碼基因在擴(kuò)增時，以銅綠假單胞菌(pseudomonas?aeruginosa)pao1為模板，利用核苷酸序列如seq?id?no.3所示的上游引物和seq?id?no.4所示的下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述銅綠假單胞菌宿主菌包括銅綠假單胞菌pao1。
9.一種銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括對所述重組銅綠假單胞菌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中包含所述銅綠假單胞菌脂蛋白脂肪酶；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述生產(chǎn)方法，其特征在于，在得到所述培養(yǎng)液后，還包括離子交換層析純化。