本發(fā)明涉及一種病原體檢測(cè)，尤其涉及qrt-pcr檢測(cè)病原體技術(shù)。
背景技術(shù)：
1、水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量在全球食品生產(chǎn)中快速增長(zhǎng)，在全球經(jīng)濟(jì)方面占有重要地位。水產(chǎn)養(yǎng)殖在提供全球營(yíng)養(yǎng)和糧食安全方面發(fā)揮著重要作用，特別是在糧食短缺的地區(qū)。集約化養(yǎng)殖方式在水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量上有突出的優(yōu)勢(shì)，但各種致病菌和病毒引起的疾病令這種養(yǎng)殖方式存在重大挑戰(zhàn)，因魚(yú)類病害造成的損失約占總產(chǎn)量的30％甚至更多。
2、水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的主要傳染病是由熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌引起的假單胞菌病、白皮病和潰瘍性疾病。熒光假單胞菌，屬于假單胞菌屬，假單胞菌科，是一種革蘭氏陰性嗜冷細(xì)菌。假單胞菌病特征是出現(xiàn)魚(yú)類潰瘍、敗血癥、點(diǎn)狀出血、皮膚變黑、鱗片脫落、腹水積聚和眼睛突出，能影響多種魚(yú)類，包括羅非魚(yú)、鯽魚(yú)和黃鯰魚(yú)等。白皮假單胞菌可感染鰱魚(yú)、鳙魚(yú)，草魚(yú)和青魚(yú)等魚(yú)類。魚(yú)類患病后從發(fā)病和死亡僅2～3天，死亡率高達(dá)50％。豚鼠氣單胞菌是一種革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，常見(jiàn)于水生環(huán)境，有可能引起魚(yú)類感染，導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病率和死亡率增加。由豚鼠氣單胞菌引起的感染通常表現(xiàn)為皮膚和鰭出血、潰瘍、腹部腫脹、突出眼、眼睛充血和鰭退化。
3、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)上述三種病原體的技術(shù)一般為依賴培養(yǎng)和不依賴培養(yǎng)。依賴培養(yǎng)方法復(fù)雜、耗時(shí)，需要4-7天的檢測(cè)時(shí)間，而且重現(xiàn)性有限。不依賴培養(yǎng)的方法主要依靠分子檢測(cè)方法，如聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)和重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)。盡管這些方法具有良好的敏感性和特異性，但也存在一定的局限性，如操作復(fù)雜、易產(chǎn)生氣溶膠污染和非特異性擴(kuò)增等。實(shí)時(shí)pcr技術(shù)由于其特殊的敏感性和特異性，被廣泛用于診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的病原體檢測(cè)，但同時(shí)檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌三種病原菌的多重實(shí)時(shí)pcr方法尚未見(jiàn)報(bào)道。若能研發(fā)一種特異性好、高靈敏度、快速的多重實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)方法，用于同時(shí)檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌三種病原體，這對(duì)于預(yù)防在水產(chǎn)養(yǎng)殖中造成重大經(jīng)濟(jì)損失的魚(yú)類疾病至關(guān)重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的引物組及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏快速準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌三種病原體的技術(shù)。
2、為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
3、一種同時(shí)檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的引物組，包括：
4、檢測(cè)熒光假單胞菌的引物組，其正向引物序列如seq?id?no.1所示，反向引物序列如seq?id?no.2所示，taqman探針序列如seq?id?no.3所示；
5、檢測(cè)白皮假單胞菌的引物組，其正向引物序列如seq?id?no.4所示，反向引物序列如seq?id?no.5所示，taqman探針序列如seq?id?no.6所示；
6、檢測(cè)豚鼠氣單胞菌的引物組，其正向引物序列如seq?id?no.7所示，反向引物序列如seq?id?no.8所示，taqman探針序列如seq?id?no.9所示；
7、seq?id?no.3、6、9所示序列的5’端分別連接不同的熒光基團(tuán)，3’端均連接淬滅基團(tuán)。
8、進(jìn)一步地，所述seq?id?no.3所示序列5’端連接fam基團(tuán)；
9、所述seq?id?no.6所示序列5’端連接cy5基團(tuán)；
10、所述seq?id?no.9所示序列5’端連接hex基團(tuán)；
11、seq?id?no.3、6、9所示序列3’端均連接bhq2基團(tuán)。
12、本發(fā)明還提供一種所述的引物組在制備檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的試劑、試劑盒中的應(yīng)用。
13、本發(fā)明還提供一種所述的引物組在制備檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的試劑、試劑盒中的應(yīng)用，包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；
14、所述陽(yáng)性對(duì)照是含有熒光假單胞菌gyrb基因、白皮假單胞菌rpod基因和豚鼠氣單胞菌metg基因部分片段的t載體克隆；
15、陰性對(duì)照是超純水。
16、本發(fā)明還提供一種含所述的引物組的qrt-pcr檢測(cè)反應(yīng)體系，成分包括：qrt-pcr反應(yīng)預(yù)混液、上述所有正向引物和反向引物、上述所有taqman探針、無(wú)核酸酶水和模板。
17、本發(fā)明還提供一種含所述的引物組的qrt-pcr檢測(cè)反應(yīng)體系，成分包括：10μltaqmantmfastadvanced預(yù)混液、上述所有正向引物和反向引物、上述所有taqman探針、4.4μl無(wú)核酸酶水和2μl模板；
18、上述所有正向引物和反向引物的用量均為0.5μl?10μm；
19、上述所有taqman探針的用量均為0.2μl?10μm。
20、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：能同時(shí)檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌，準(zhǔn)確率高，檢測(cè)速度快，成本低，靈敏度高，對(duì)于熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的最低檢出限為103copies/μl。
1.一種同時(shí)檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的引物組，其特征在于：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的引物組，其特征在于：
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的引物組在制備檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的試劑、試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種如權(quán)利要求3所述的引物組在制備檢測(cè)熒光假單胞菌、白皮假單胞菌和豚鼠氣單胞菌的試劑、試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于：
5.一種含如權(quán)利要求1所述的或2所述的引物組的qrt-pcr檢測(cè)反應(yīng)體系，其特征在于：
6.一種含如權(quán)利要求5所述的qrt-pcr檢測(cè)反應(yīng)體系，其特征在于：