本發(fā)明屬于基因工程，涉及效應(yīng)蛋白hasp?97在改良小麥抗病性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、條形柄銹菌小麥?；停╬uccinia?striiformis?f.?sp.?tritici,?pst）是一種專性寄生菌，其侵染小麥（triticum?aestivum?l.）所引起的小麥條銹?。╳heat?striperust）是小麥生產(chǎn)上的主要病害之一。小麥條銹病自小麥出苗至成熟都有可能會發(fā)生，小麥條銹病菌隨高空氣流傳播引起的小麥條銹病屬于典型的氣傳病害，種植抗病品種是防控小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。小麥條銹菌致病性變異不斷產(chǎn)生新菌系，導(dǎo)致品種垂直抗性容易“喪失”，多次優(yōu)勢小種的改變，使得小麥條銹菌的防治難上加難，傳統(tǒng)抗銹育種面臨著抗病種質(zhì)資源有限、基因資源挖掘不足的難題。

2、病原菌可以通過分泌小分子蛋白——效應(yīng)蛋白（effector），來干擾寄主免疫，促進(jìn)侵染，建立與寄主的親和性互作，引起寄主感病（effector-triggered?susceptibility,ets），效應(yīng)蛋白可以通過多種方式調(diào)控寄主免疫反應(yīng)以及促進(jìn)病原菌侵染，是病原菌重要的毒力因子。小麥條銹菌可通過效應(yīng)蛋白影響光系統(tǒng)電子傳遞，繼而抑制寄主的光合作用以及?ros?的產(chǎn)生，促進(jìn)自身存活。效應(yīng)蛋白利用寄主感病基因促進(jìn)侵染，增強(qiáng)了感病基因激酶活性和入核，在細(xì)胞核降低了其下游防御相關(guān)基因的表達(dá)。效應(yīng)蛋白還可通過影響寄主可變剪切（alternative?splicing）干擾防御基因的應(yīng)答。植物中的nlr作為胞內(nèi)免疫受體識別這些效應(yīng)蛋白，在沒有病原菌存在時(shí)，nlr通過不同的分子間或分子內(nèi)互作處于自抑制的狀態(tài)，一旦識別到病原菌，這些“互作”就被破壞，植物迅速激活免疫反應(yīng)，包括防御基因的表達(dá)、活性氧迸發(fā)等過程，常常還伴隨著hr反應(yīng)，激活更加強(qiáng)烈、穩(wěn)健的免疫應(yīng)答（effector-triggered?immunity，eti）。由此，挖掘新的病原菌效應(yīng)蛋白并解析其作用機(jī)理對于防控植物病害具有十分重要的意義，為抗病品種的培育奠定理論基礎(chǔ)。挖掘小麥抗病基因資源，加快創(chuàng)制并培育抗條銹病新品種具有深遠(yuǎn)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于探究其在小麥條銹菌侵染過程中的作用機(jī)制，完善對病原菌發(fā)病機(jī)制的了解，解決傳統(tǒng)抗病育種存在生殖隔離和遠(yuǎn)緣雜交不親和性，在較短培育周期內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的定向改良。

2、為了完整無異議地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，需要補(bǔ)充說明的是，本發(fā)明所述效應(yīng)蛋白或小麥條銹菌效應(yīng)蛋白用非傾斜字體“hasp?97”表示，其編碼基因用傾斜字體“ hasp? 97”表示。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的記載，可以清楚、完整地理解相關(guān)基因及其編碼蛋白的含義與表述。

3、一方面，本發(fā)明涉及效應(yīng)蛋白hasp?97在改良小麥抗病性中的應(yīng)用，所述效應(yīng)蛋白hasp?97由 hasp?97基因編碼，所述效應(yīng)蛋白hasp?97的氨基酸序列如seq?id?no：1所示；

4、沉默、降低或敲除所述 hasp?97基因，增強(qiáng)小麥對條銹病的抗性。

5、seq?id?no：1具體如下所示，

6、mirlsmialvcfalrctlaapsldvstapivqaigslanlpfqdlqphkpfpvdsartlnylkhfdplkhfpdekihtevpggknvelqvprqqnsrkefksnimkppqarmkmdrtrtptqeeeikinnilnnypvghayqltdtpepvilaapifdfeyacgkdkiygidgaliketgcfhwngpcveeclveayvdclkgssksskskksydnsnysrkii。

7、進(jìn)一步地，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，所述 hasp?97基因的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

8、seq?id?no：2具體如下所示，

9、atgataaggttgtccatgattgcgctcgtatgcttcgcattgagatgcaccttggctgcgccctctcttgacgtatcaactgccccaatagttcaagcaataggttcattagcaaatcttccattccaggatcttcaaccacataagccgtttccagtggactcggcccgtactttgaactacttgaaacacttcgatcccctcaagcatttcccagacgaaaaaattcacactgaagtaccaggtgggaagaacgtcgaactgcaagtaccaagacaacaaaattctcgcaaagagttcaaatctaacatcatgaaaccacctcaagcaagaatgaagatggaccgaactcggactccaacgcaagaagaggaaatcaaaattaataatattctcaacaattatccggtggggcacgcttatcagcttactgatacacccgaaccagtaattctggcggcacctatctttgatttcgaatacgcatgtgggaaggacaagatctatggtattgatggagcccttataaaagaaacgggctgcttccattggaacggtccatgtgtagaagaatgcctagtggaagcctacgtggattgtctcaaagggtctagcaaatcaagtaaatcgaagaagagttacgacaactcgaactattctcgcaaaattatttga。

10、進(jìn)一步，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，沉默、降低或敲除所述 hasp?97基因，增強(qiáng)小麥對條銹菌的抗性。

11、進(jìn)一步，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，沉默、降低或敲除所述 hasp?97基因，降低條銹菌的產(chǎn)孢。

12、進(jìn)一步，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，構(gòu)建沉默所述 hasp?97基因的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包含如seq?id?no：2所示的核苷酸序列。

13、另一方面，本發(fā)明涉及一種小麥抗銹病品種的培育方法，沉默、降低或敲除小麥中的 hasp?97基因，所述 hasp?97基因編碼效應(yīng)蛋白hasp?97，所述效應(yīng)蛋白hasp?97的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

14、進(jìn)一步地，在本發(fā)明提供的小麥抗銹病品種的培育方法中，所述 hasp?97基因的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

15、進(jìn)一步地，在本發(fā)明提供的小麥抗銹病品種的培育方法中，構(gòu)建沉默所述 hasp?97基因的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包含如seq?id?no：2所示的核苷酸序列，將所述表達(dá)載體導(dǎo)入小麥的幼胚中，得到小麥抗條銹病品種。

16、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼效應(yīng)蛋白hasp?97的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的 hasp?97基因的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼效應(yīng)蛋白hasp?97且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

17、這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼seq?id?no：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用來評價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

18、上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。

19、本發(fā)明沉默、降低或敲除所述 hasp?97基因的目的在于，降低小麥中效應(yīng)蛋白hasp97的活性和/或表達(dá)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過vigs、rna干擾、同源重組、基因定點(diǎn)編輯等本領(lǐng)域熟知的方法，達(dá)到降低小麥中效應(yīng)蛋白hasp?97活性和/或表達(dá)量的目的。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案至少具備以下有益效果或優(yōu)點(diǎn)：

21、（1）與傳統(tǒng)抗病育種技術(shù)相比，植物抗病基因工程技術(shù)可以突破物種間的生殖隔離和遠(yuǎn)緣雜交不親合性，在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的定向改良，給作物提供更為全面、持續(xù)、廣譜的保護(hù)。本發(fā)明通過基因工程研究，發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白hasp?97在條銹菌與小麥互作中有促進(jìn)條銹菌侵染作用，同時(shí)條銹菌侵染小麥過程也會促進(jìn)效應(yīng)蛋白hasp97的表達(dá)，即沉默、降低或敲除小麥條銹菌效應(yīng)蛋白hasp?97的基因表達(dá)能夠提高條銹菌對小麥的侵染能力。調(diào)控小麥條銹菌效應(yīng)蛋白hasp?97的基因片段在植物體內(nèi)基因沉默表達(dá)時(shí)，可賦予植物一定的抗病性。

22、（2）本發(fā)明提供了一種小麥抗條銹病品種培育方法。該方法借助基因工程技術(shù)，在小麥植株體內(nèi)基因沉默所述的 hasp?97基因，增強(qiáng)小麥對條銹病病菌的抗性。經(jīng)驗(yàn)證，采用本發(fā)明方法獲得的基因沉默表達(dá)效應(yīng)蛋白hasp?97的小麥對條銹菌主要的流行小種表現(xiàn)出更抗病。本發(fā)明為從分子生物學(xué)角度開展小麥抗條銹病品種培育提供了新的技術(shù)思路，有效解決了本發(fā)明的技術(shù)問題。