本發(fā)明涉及生物工程，更具體的說(shuō)是涉及一種增加骨密度的活性骨髓肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、骨髓肽是從動(dòng)物骨髓中提取的小分子活性肽，通常通過(guò)酶解或生物技術(shù)分解骨髓蛋白獲得。這類(lèi)肽富含膠原蛋白、氨基酸、礦物質(zhì)和生長(zhǎng)因子等成分，被認(rèn)為具有多種生物活性，如提高免疫力、抗氧化與抗衰老、補(bǔ)血造血、抗疲勞、神經(jīng)保護(hù)等。

2、現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于骨髓肽的制備多采用酶解法、酸/堿水解法、物理輔助提取法、發(fā)酵法或超濾層析純化法。但上述方法存在如下技術(shù)問(wèn)題：酶解效率低：骨髓蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如膠原蛋白交聯(lián)度高），常規(guī)酶解難以完全水解，需復(fù)合酶協(xié)同作用，但成本高且工藝優(yōu)化困難；活性肽得率低：目標(biāo)肽段分子量分布廣，現(xiàn)有分離技術(shù)（如超濾）可能損失小分子活性肽或無(wú)法有效去除苦味肽；產(chǎn)物穩(wěn)定性差：提取的肽易受溫度、ph影響而降解，且骨髓中含有的內(nèi)源性酶（如脂肪酶）可能導(dǎo)致儲(chǔ)存期間活性下降以及無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)等問(wèn)題。

3、目前，磁吸附技術(shù)多用于蛋白質(zhì)、多肽的分離純化，也存在磁吸附技術(shù)在活性肽制備中的應(yīng)用，如公告號(hào)為cn?106011206?a的發(fā)明專(zhuān)利，公開(kāi)了采用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法。但該現(xiàn)有技術(shù)是磁性載體以酶固定化為目標(biāo)，材料表面活性位點(diǎn)易被酶占據(jù)，負(fù)載效率低，且酶固定化材料易因酶失活或脫落導(dǎo)致重復(fù)使用性差，分離制備效果差。

4、因此，如何提供一種可重復(fù)利用的磁吸附材料，如何提供活性肽的獲取率，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種增加骨密度的活性骨髓肽及其制備方法和應(yīng)用，采用磁性復(fù)合材料對(duì)活性骨髓肽進(jìn)行制備，不僅僅簡(jiǎn)化了活性骨髓肽的制備流程，且磁性復(fù)合材料可重復(fù)利用，再者采用該磁性復(fù)合材料可以成功制備得到具有增加骨密度功效的活性骨髓肽，為骨密度功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)支持。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種增加骨密度的活性骨髓肽的制備方法，包括如下步驟：

4、s1：按照50-70份羧基化fe3o4納米顆粒、15-25份殼聚糖、10-20份骨髓肽和3-7份edc?交聯(lián)劑的組成和配比制備磁性復(fù)合材料，備用；

5、s2：將s1中獲取的磁性復(fù)合材料與骨髓勻漿液混合，加入勻漿液體積0.1-0.3%的檸檬酸鈉，在20-30℃條件下攪拌20-40min；

6、s3：將s2處理后得到的產(chǎn)物置于0.2-0.4t磁場(chǎng)中，磁分離得到磁性復(fù)合材料-生物分子復(fù)合物；

7、s4：采用甘氨酸-hcl緩沖液對(duì)磁性復(fù)合材料-生物分子復(fù)合物進(jìn)行震蕩解離洗脫，超濾膜濃縮、凍干，制備得到活性骨髓肽。

8、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，s1所述磁性復(fù)合材料的具體制備方法如下：

9、（1）羧基活化：將羧基化fe3o4納米顆粒分散于mes緩沖液中，然后加入edc和nhs交聯(lián)劑，室溫震蕩15-45min，得混懸液；

10、（2）偶聯(lián)反應(yīng)：向步驟（1）所得混懸液中加入殼聚糖，調(diào)整ph至5.5–6.5，室溫反應(yīng)2–4h；隨后加入骨髓肽，調(diào)節(jié)ph至7.0–7.4，繼續(xù)反應(yīng)6–12h;

11、（3）終止與清洗：向步驟（2）混懸液中加入甘氨酸，封閉未反應(yīng)基團(tuán)，磁分離，清洗，制備得到磁性復(fù)合材料。

12、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述羧基化fe3o4納米顆粒的濃度為0.5-2mg/ml；所述mes緩沖溶液的ph為5.5-6.5；所述edc的濃度為8-12mm；所述nhs的濃度為4-6mm；所述edc和nhs交聯(lián)劑摩爾比為2：1；所述甘氨酸的濃度為0.05-0.2m，ph為7.5-8.5。

13、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述羧基化fe3o4納米顆粒的粒徑為15-25nm，其表面修飾有硅烷偶聯(lián)劑kh-560；所述殼聚糖的脫乙酰度≥85%，其表面修飾有peg；所述骨髓肽的分子量<1.5kda。

14、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，s2所述磁性復(fù)合材料和骨髓勻漿液按?1:5–1:20的質(zhì)量體積比混合；所述骨髓勻漿液的ph為5.5-6.5；所述磁性復(fù)合材料可重復(fù)使用3-7次；

15、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，s3所述磁分離的時(shí)間為1-3min；

16、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，s4所述甘氨酸-hcl緩沖液的ph為2.0-3.0，含體積百分?jǐn)?shù)0.01-0.05%的tween-20；所述甘氨酸-hcl緩沖液的用量為磁性復(fù)合材料-生物分子復(fù)合物體積的1.5-2.5倍；所述震蕩解離洗脫的時(shí)間為8-12min；所述超濾膜的截留分子量為2-5kda。

17、上述操作的有益效果為：tween-20作為表面活性劑，通過(guò)降低溶液表面張力，促進(jìn)活性肽從磁性復(fù)合材料表面解離，同時(shí)減少活性肽在解離過(guò)程中的損失。

18、本發(fā)明的再一目的在于提供：上述方法制備得到的活性骨髓肽。

19、本發(fā)明的再一目的在于提供：上述活性骨髓肽在制備提高骨密度產(chǎn)品中的應(yīng)用。

20、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

21、本發(fā)明方法首先通過(guò)羧基化fe3o4納米顆粒、殼聚糖、edc交聯(lián)劑與鱘魚(yú)骨髓肽共價(jià)偶聯(lián)形成磁性復(fù)合材料，殼聚糖（氨基）與羧基化fe3o4（羧基）通過(guò)edc交聯(lián)形成穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合骨髓肽的氨基/羧基；分步偶聯(lián)工藝：先偶聯(lián)殼聚糖，再引入骨髓肽，避免競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。其中羧基化fe3o4納米顆粒表面修飾有kh-560，kh-560通過(guò)硅氧鍵與fe3o4納米顆粒表面結(jié)合，增強(qiáng)了界面結(jié)合強(qiáng)度，確保磁性復(fù)合材料在多次使用后仍保持較高的吸附效率，同時(shí)提高了磁性復(fù)合材料的機(jī)械穩(wěn)定性和抗降解性能。

22、殼聚糖分子鏈通過(guò)edc交聯(lián)劑與羧基化fe3o4納米顆粒表面的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，形成共價(jià)鍵連接。殼聚糖分子鏈之間通過(guò)氫鍵作用形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠有效負(fù)載鱘魚(yú)骨髓肽并增強(qiáng)其結(jié)合能力。骨髓肽通過(guò)edc交聯(lián)劑與殼聚糖表面的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵連接，提高了骨髓肽在磁性復(fù)合材料上的負(fù)載效率和選擇性。

23、磁性復(fù)合材料表面修飾層中的peg分子鏈通過(guò)空間位阻效應(yīng)降低蛋白質(zhì)等雜質(zhì)非特異性吸附，增強(qiáng)材料親水性，提高了活性肽分離過(guò)程的選擇性和純度，延緩了磁性復(fù)合材料的性能衰減，確保其在多次使用后仍保持較高的吸附效率。同時(shí)提高磁性復(fù)合材料在水相體系中的分散性和穩(wěn)定性。

24、在分離過(guò)程中，磁性復(fù)合材料與鱘魚(yú)骨髓勻漿液混合后，鱘魚(yú)骨髓肽通過(guò)共價(jià)鍵和氫鍵作用被吸附到磁性復(fù)合材料表面，通過(guò)磁場(chǎng)吸附分離磁性復(fù)合材料后，采用甘氨酸-hcl緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫后的活性肽經(jīng)過(guò)超濾膜濃縮后凍干得到最終產(chǎn)物。

25、綜上，本發(fā)明技術(shù)路線的革新在于，從酶解到直接分離，直接利用磁性復(fù)合材料從骨髓勻漿液中分離天然活性骨髓肽，省去酶解步驟，避免酶活損失及副反應(yīng)，顯著提升產(chǎn)物純度，縮短工藝流程（減少2-3步），降低能耗，更適用于天然活性肽的高效制備。另外，本發(fā)明首次將磁性分離的骨髓肽直接應(yīng)用于骨密度產(chǎn)品，開(kāi)辟了骨髓肽新的使用路徑。