本發(fā)明涉及生物工程,更具體的說(shuō)是涉及一種增加骨密度的活性骨髓肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、骨髓肽是從動(dòng)物骨髓中提取的小分子活性肽,通常通過(guò)酶解或生物技術(shù)分解骨髓蛋白獲得。這類(lèi)肽富含膠原蛋白、氨基酸、礦物質(zhì)和生長(zhǎng)因子等成分,被認(rèn)為具有多種生物活性,如提高免疫力、抗氧化與抗衰老、補(bǔ)血造血、抗疲勞、神經(jīng)保護(hù)等。
2、現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于骨髓肽的制備多采用酶解法、酸/堿水解法、物理輔助提取法、發(fā)酵法或超濾層析純化法。但上述方法存在如下技術(shù)問(wèn)題:酶解效率低:骨髓蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜(如膠原蛋白交聯(lián)度高),常規(guī)酶解難以完全水解,需復(fù)合酶協(xié)同作用,但成本高且工藝優(yōu)化困難;活性肽得率低:目標(biāo)肽段分子量分布廣,現(xiàn)有分離技術(shù)(如超濾)可能損失小分子活性肽或無(wú)法有效去除苦味肽;產(chǎn)物穩(wěn)定性差:提取的肽易受溫度、ph影響而降解,且骨髓中含有的內(nèi)源性酶(如脂肪酶)可能導(dǎo)致儲(chǔ)存期間活性下降以及無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)等問(wèn)題。
3、目前,磁吸附技術(shù)多用于蛋白質(zhì)、多肽的分離純化,也存在磁吸附技術(shù)在活性肽制備中的應(yīng)用,如公告號(hào)為cn?106011206?a的發(fā)明專(zhuān)利,公開(kāi)了采用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法。但該現(xiàn)有技術(shù)是磁性載體以酶固定化為目標(biāo),材料表面活性位點(diǎn)易被酶占據(jù),負(fù)載效率低,且酶固定化材料易因酶失活或脫落導(dǎo)致重復(fù)使用性差,分離制備效果差。
4、因此,如何提供一種可重復(fù)利用的磁吸附材料,如何提供活性肽的獲取率,是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此,本發(fā)明提供了一種增加骨密度的活性骨髓肽及其制備方法和應(yīng)用,采用磁性復(fù)合材料對(duì)活性骨髓肽進(jìn)行制備,不僅僅簡(jiǎn)化了活性骨髓肽的制備流程,且磁性復(fù)合材料可重復(fù)利用,再者采用該磁性復(fù)合材料可以成功制備得到具有增加骨密度功效的活性骨髓肽,為骨密度功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)支持。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
3、一種增加骨密度的活性骨髓肽的制備方法,包括如下步驟:
4、s1:按照50-70份羧基化fe3o4納米顆粒、15-25份殼聚糖、10-20份骨髓肽和3-7份edc?交聯(lián)劑的組成和配比制備磁性復(fù)合材料,備用;
5、s2:將s1中獲取的磁性復(fù)合材料與骨髓勻漿液混合,加入勻漿液體積0.1-0.3%的檸檬酸鈉,在20-30℃條件下攪拌20-40min;
6、s3:將s2處理后得到的產(chǎn)物置于0.2-0.4t磁場(chǎng)中,磁分離得到磁性復(fù)合材料-生物分子復(fù)合物;
7、s4:采用甘氨酸-hcl緩沖液對(duì)磁性復(fù)合材料-生物分子復(fù)合物進(jìn)行震蕩解離洗脫,超濾膜濃縮、凍干,制備得到活性骨髓肽。
8、作為優(yōu)選的技術(shù)方案,s1所述磁性復(fù)合材料的具體制備方法如下:
9、(1)羧基活化:將羧基化fe3o4納米顆粒分散于mes緩沖液中,然后加入edc和nhs交聯(lián)劑,室溫震蕩15-45min,得混懸液;
10、(2)偶聯(lián)反應(yīng):向步驟(1)所得混懸液中加入殼聚糖,調(diào)整ph至5.5–6.5,室溫反應(yīng)2–4h;隨后加入骨髓肽,調(diào)節(jié)ph至7.0–7.4,繼續(xù)反應(yīng)6–12h;
11、(3)終止與清洗:向步驟(2)混懸液中加入甘氨酸,封閉未反應(yīng)基團(tuán),磁分離,清洗,制備得到磁性復(fù)合材料。
12、作為優(yōu)選的技術(shù)方案,所述羧基化fe3o4納米顆粒的濃度為0.5-2mg/ml;所述mes緩沖溶液的ph為5.5-6.5;所述edc的濃度為8-12mm;所述nhs的濃度為4-6mm;所述edc和nhs交聯(lián)劑摩爾比為2:1;所述甘氨酸的濃度為0.05-0.2m,ph為7.5-8.5。
13、作為優(yōu)選的技術(shù)方案,所述羧基化fe3o4納米顆粒的粒徑為15-25nm,其表面修飾有硅烷偶聯(lián)劑kh-560;所述殼聚糖的脫乙酰度≥85%,其表面修飾有peg;所述骨髓肽的分子量<1.5kda。
14、作為優(yōu)選的技術(shù)方案,s2所述磁性復(fù)合材料和骨髓勻漿液按?1:5–1:20的質(zhì)量體積比混合;所述骨髓勻漿液的ph為5.5-6.5;所述磁性復(fù)合材料可重復(fù)使用3-7次;
15、作為優(yōu)選的技術(shù)方案,s3所述磁分離的時(shí)間為1-3min;
16、作為優(yōu)選的技術(shù)方案,s4所述甘氨酸-hcl緩沖液的ph為2.0-3.0,含體積百分?jǐn)?shù)0.01-0.05%的tween-20;所述甘氨酸-hcl緩沖液的用量為磁性復(fù)合材料-生物分子復(fù)合物體積的1.5-2.5倍;所述震蕩解離洗脫的時(shí)間為8-12min;所述超濾膜的截留分子量為2-5kda。
17、上述操作的有益效果為:tween-20作為表面活性劑,通過(guò)降低溶液表面張力,促進(jìn)活性肽從磁性復(fù)合材料表面解離,同時(shí)減少活性肽在解離過(guò)程中的損失。
18、本發(fā)明的再一目的在于提供:上述方法制備得到的活性骨髓肽。
19、本發(fā)明的再一目的在于提供:上述活性骨髓肽在制備提高骨密度產(chǎn)品中的應(yīng)用。
20、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知,與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:
21、本發(fā)明方法首先通過(guò)羧基化fe3o4納米顆粒、殼聚糖、edc交聯(lián)劑與鱘魚(yú)骨髓肽共價(jià)偶聯(lián)形成磁性復(fù)合材料,殼聚糖(氨基)與羧基化fe3o4(羧基)通過(guò)edc交聯(lián)形成穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò),結(jié)合骨髓肽的氨基/羧基;分步偶聯(lián)工藝:先偶聯(lián)殼聚糖,再引入骨髓肽,避免競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。其中羧基化fe3o4納米顆粒表面修飾有kh-560,kh-560通過(guò)硅氧鍵與fe3o4納米顆粒表面結(jié)合,增強(qiáng)了界面結(jié)合強(qiáng)度,確保磁性復(fù)合材料在多次使用后仍保持較高的吸附效率,同時(shí)提高了磁性復(fù)合材料的機(jī)械穩(wěn)定性和抗降解性能。
22、殼聚糖分子鏈通過(guò)edc交聯(lián)劑與羧基化fe3o4納米顆粒表面的羧基發(fā)生酯化反應(yīng),形成共價(jià)鍵連接。殼聚糖分子鏈之間通過(guò)氫鍵作用形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠有效負(fù)載鱘魚(yú)骨髓肽并增強(qiáng)其結(jié)合能力。骨髓肽通過(guò)edc交聯(lián)劑與殼聚糖表面的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng),形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵連接,提高了骨髓肽在磁性復(fù)合材料上的負(fù)載效率和選擇性。
23、磁性復(fù)合材料表面修飾層中的peg分子鏈通過(guò)空間位阻效應(yīng)降低蛋白質(zhì)等雜質(zhì)非特異性吸附,增強(qiáng)材料親水性,提高了活性肽分離過(guò)程的選擇性和純度,延緩了磁性復(fù)合材料的性能衰減,確保其在多次使用后仍保持較高的吸附效率。同時(shí)提高磁性復(fù)合材料在水相體系中的分散性和穩(wěn)定性。
24、在分離過(guò)程中,磁性復(fù)合材料與鱘魚(yú)骨髓勻漿液混合后,鱘魚(yú)骨髓肽通過(guò)共價(jià)鍵和氫鍵作用被吸附到磁性復(fù)合材料表面,通過(guò)磁場(chǎng)吸附分離磁性復(fù)合材料后,采用甘氨酸-hcl緩沖液進(jìn)行洗脫,洗脫后的活性肽經(jīng)過(guò)超濾膜濃縮后凍干得到最終產(chǎn)物。
25、綜上,本發(fā)明技術(shù)路線的革新在于,從酶解到直接分離,直接利用磁性復(fù)合材料從骨髓勻漿液中分離天然活性骨髓肽,省去酶解步驟,避免酶活損失及副反應(yīng),顯著提升產(chǎn)物純度,縮短工藝流程(減少2-3步),降低能耗,更適用于天然活性肽的高效制備。另外,本發(fā)明首次將磁性分離的骨髓肽直接應(yīng)用于骨密度產(chǎn)品,開(kāi)辟了骨髓肽新的使用路徑。