本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別是涉及一種來源于魚腥草的外泌體樣納米囊泡的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、癌癥是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，肺癌是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因。目前來講，癌癥的有效治療方法主要包括手術(shù)切除、放療和化療。但它們都有著各自的局限性：手術(shù)切除容易造成較大的創(chuàng)傷，而且往往會(huì)因?yàn)榍谐粡氐滓鹉[瘤復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移；放療不僅會(huì)由于部分腫瘤對放射線不敏感導(dǎo)致療效很差，而且還有可能損傷癌細(xì)胞周圍的正常組織，從而出現(xiàn)如器官衰竭等嚴(yán)重后遺癥；作為最常用也是相對最有效的癌癥治療方式，化療是通過細(xì)胞毒性來消除腫瘤，但小分子藥物往往會(huì)在腫瘤組織中非特異性積累導(dǎo)致出現(xiàn)很嚴(yán)重的毒副作用。因此，探索更安全、更有效的癌癥治療方法至關(guān)重要。
2、外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的納米級(jí)膜泡，其直徑通常在30-150nm之間。其蘊(yùn)含著蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等豐富的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞間通訊中扮演著重要角色，如同細(xì)胞的“信息快遞員”。主要分布在各種體液中，具有細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、促血管新生、抗腫瘤免疫等功能，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān)，不僅可以作為診斷多種疾病的生物指標(biāo)，也可以作為治療手段。
3、魚腥草(houttuynia?cordata?thunb.)為三白草科植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分，主要產(chǎn)于我國長江流域以南，其性微寒、味辛，主入肺經(jīng)，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效，常用于治療肺癰咳吐膿血、痰熱咳喘、熱痢、熱淋、癰腫瘡毒等病癥。已有研究表明，魚腥草提取物及其活性成分具有顯著的抗炎作用，能夠有效減輕多種炎癥性疾病的癥狀。此外，魚腥草對肺部疾病有良好的治療效果；另有研究顯示魚腥草提取物對結(jié)腸癌、白血病、肺癌、肝癌均有明顯的抑制作用，其潛在的抗腫瘤機(jī)制可能涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移等多個(gè)方面，為攻克癌癥難題帶來新的曙光。因此，研究魚腥草外泌體樣納米囊泡的提取方法以其應(yīng)用研究具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是提供一種來源于魚腥草的外泌體樣納米囊泡的制備方法及其應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。本發(fā)明根據(jù)魚腥草的植物特點(diǎn)對其進(jìn)行外泌體的提取和應(yīng)用，證實(shí)了其具有抗腫瘤的作用。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：
3、技術(shù)方案一：一種來源于魚腥草的外泌體樣納米囊泡的制備方法，包括將魚腥草汁液依次進(jìn)行4000rpm離心40min和10000rpm離心60min的步驟。
4、進(jìn)一步地，所述步驟具體包括：
5、將魚腥草榨汁后過濾，獲得魚腥草汁液，所述魚腥草汁液依次進(jìn)行4000rpm離心40min和10000rpm離心60min，收集上清后通過450nm微孔濾膜過濾獲得濾液，將所述濾液與peg?6000溶液等體積混合，靜置后低速離心得到沉淀，將所述沉淀用pbs重懸后過濾，得到所述魚腥草源外泌體樣納米囊泡。
6、進(jìn)一步地，所述魚腥草汁液是將洗凈的魚腥草與pbs進(jìn)行榨汁處理得到。
7、魚腥草汁液的制備包括：洗凈魚腥草，在榨汁機(jī)中加入預(yù)冷后的pbs，用榨汁機(jī)破碎，破碎1min間停1min，反復(fù)5次后，以紗布濾去魚腥草殘?jiān)?，收集得到魚腥草汁液。
8、進(jìn)一步地，所述靜置是在4℃下放置24h。
9、進(jìn)一步地，所述低速離心是在4℃，10000rpm離心60min。
10、進(jìn)一步地，所述用pbs重懸后過濾是用220nm微孔濾膜過濾。
11、技術(shù)方案二：所述的制備方法制備得到的魚腥草源外泌體樣納米囊泡。
12、技術(shù)方案三：所述的魚腥草源外泌體樣納米囊泡在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
13、本發(fā)明制備得到的主要代謝產(chǎn)物如表1所示，其中，魚腥草源外泌體樣納米囊泡中的活性代謝產(chǎn)物還可用于制備抗腫瘤藥物，抗腫瘤包括抑制肺癌細(xì)胞增殖。
14、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：
15、本發(fā)明對魚腥草源外泌體樣納米囊泡(houttuynia?cordata?thunb-derivedexosome-like?nanovesicles,helns)進(jìn)行提取分離，并使用tem和nanosight對所提的helns形態(tài)、大小、濃度及zeta電位進(jìn)行鑒定表征，透射電子顯微鏡下觀察到，提取得到的helns為橢圓形囊泡，zeta電位為-35.8mv，濃度為2.63×109particles/ml，粒徑集中于114nm，證明helns被提取成功。helns代謝物分析結(jié)果顯示，羧酸及其衍生物占比23.29％；脂肪?；急?0.96％；異戊二烯脂質(zhì)占比10.27％；黃酮類占比8.22％。cck-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，a549細(xì)胞的ic50＝44.94μg/ml，pc-9細(xì)胞的ic50＝39.15μg/ml。helns攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，helns成功被a549細(xì)胞和pc-9細(xì)胞攝取。此外，本發(fā)明利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果共找尋到46個(gè)helns作用于肺癌的靶點(diǎn)，go和kegg結(jié)果表明helns抑制肺癌主要是通過調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶b信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、mirna轉(zhuǎn)錄、體液免疫應(yīng)答、血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、基因表達(dá)、凋亡過程、rna聚合酶ⅱ對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等生物學(xué)過程，而主要影響的信號(hào)通路有：癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的途徑、p13-akt信號(hào)通路、hif-1信號(hào)通路、rap信號(hào)通路、癌癥中的microrna、vegf信號(hào)通路等。
16、本發(fā)明制備得到的魚腥草源外泌體樣納米囊泡具有安全、經(jīng)濟(jì)、低毒，還擁有良好的生物相容性和納米級(jí)結(jié)構(gòu)，為攻克癌癥難題帶來新的曙光。本發(fā)明提取得到了魚腥草的關(guān)鍵活性成分，從而增強(qiáng)了外泌體在抗腫瘤方面的生物活性，因此，本發(fā)明提供的helns的提取方法以其應(yīng)用研究具有重要意義。
1.一種來源于魚腥草的外泌體樣納米囊泡的制備方法，其特征在于，包括將魚腥草汁液依次進(jìn)行4000rpm離心40min和10000rpm離心60min的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟具體包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述魚腥草汁液是將洗凈的魚腥草與pbs進(jìn)行榨汁處理得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述靜置是在4℃下放置24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述低速離心是在4℃，10000rpm離心60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述用pbs重懸后過濾是用220nm微孔濾膜過濾。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的魚腥草源外泌體樣納米囊泡。
8.權(quán)利要求7所述的魚腥草源外泌體樣納米囊泡在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。