本發(fā)明屬于食品檢測，具體涉及一種檢測飲料中l(wèi)-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖含量的方法。

背景技術(shù)：

1、l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖在食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，特別是在食品如飲料中應(yīng)用更加廣泛。

2、因此為了確保產(chǎn)品一致性，滿足標(biāo)簽標(biāo)識要求，保障消費者健康以及滿足特殊人群需求，需要對含有l(wèi)-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖的飲料或者其他食品進(jìn)行l(wèi)-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖含量的檢測。

3、目前，檢測飲料中l(wèi)-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖的技術(shù)難點可能主要包括以下幾個方面：(1)成分復(fù)雜性：飲料中通常含有多種成分，包括糖類、酸類、色素、防腐劑等，這些成分可能對l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖的檢測造成干擾，增加檢測的難度和復(fù)雜性。(2)檢測困難：l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖由于自身結(jié)構(gòu)特點，紫外光和熒光下沒有特征吸收，無法使用常見的紫外檢測器或者熒光檢測器進(jìn)行檢測。(3)含量低：在某些飲料中，l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖的含量可能非常低，這要求檢測方法具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性，以便能夠準(zhǔn)確檢測出這些低含量的成分。

4、有鑒于此，針對l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖的檢測，開發(fā)出一種準(zhǔn)確、可靠、簡便的檢測方法，對于飲料行業(yè)甚至食品行業(yè)具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與不足，本發(fā)明提供一種檢測飲料中l(wèi)-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖含量的方法，該方法通過針對試樣提取以及凈化過程中進(jìn)行了一定優(yōu)化，有效地提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，可適用于不同類型飲料的檢測。

2、本發(fā)明提供一種檢測飲料中l(wèi)-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖含量的方法，包括如下步驟：s1.提取，首先利用水溶解試樣，離心處理后，取第一上清液，接著向第一上清液中加入第一有機(jī)溶劑混合均勻，得到混合溶液；第一上清液與第一有機(jī)溶劑的體積比為10～30：70～90；第一有機(jī)溶劑包括乙腈；s2.凈化，將所述混合溶液移入已活化的氨基固相萃取柱，到柱中液體完全排出后，使用第二有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液后，去除洗脫液中的溶劑，復(fù)溶，過濾，收集濾液；第二有機(jī)溶劑包括甲醇；s3.制作關(guān)于l-巖藻糖醇、海藻糖、以及棉籽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線；s4.將濾液進(jìn)樣至高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中以確定試樣中l(wèi)-巖藻糖醇、海藻糖、以及棉籽糖的含量。

3、如上背景技術(shù)中提到，目前關(guān)于l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖含量的檢測方法中，存在著成分復(fù)雜性、檢測困難以及含量低等問題，使得這幾種糖或糖醇的檢測準(zhǔn)確度以及靈敏度較差。因此，如何進(jìn)一步針對上述問題之一提出進(jìn)一步的解決方案，以提高上述幾種糖或糖醇的檢測準(zhǔn)確度以及靈敏度，對于食品檢測行業(yè)尤為重要。

4、因此，在本發(fā)明所提供的關(guān)于l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖含量的檢測方法中，特定設(shè)置了對試樣凈化的處理步驟，特別是選擇了氨基固相萃取柱對試樣進(jìn)行凈化，可以對試樣中的雜質(zhì)起到良好的去除作用，因此在很大程度上避免其他雜質(zhì)成分對檢測的干擾，也避免結(jié)構(gòu)相似的物料出鋒而導(dǎo)致在檢測過程中出現(xiàn)誤判或漏判的情況，而且對雜質(zhì)進(jìn)行了良好的去除后，能夠使得l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖的出峰更加明顯，進(jìn)而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。此外，使用氨基固相萃取柱能夠使目標(biāo)物l-巖藻糖醇、海藻糖以及棉籽糖很好的保留在填料中，不會隨著去除干擾物的上樣液及淋洗液流出，而絕大部分的干擾物雜質(zhì)隨溶劑流出，能達(dá)到分離脂溶性維生素、核苷酸和水溶性維生素等雜質(zhì)的效果。且氨基固相萃取柱適用于不同類型的飲料，即使成分差異較大的飲料使用氨基固相萃取柱后也能夠取得較好的凈化效果。還有，本發(fā)明還使用了其他固相萃取柱進(jìn)行凈化處理，發(fā)現(xiàn)使用其他固相萃取柱時，目標(biāo)物l-巖藻糖醇、海藻糖以及棉籽糖無法在這些固相萃取柱填料中得到有效保留，會隨著上樣液及淋洗液流出，難以達(dá)到去除干擾物的效果。

5、由此，根據(jù)氨基固相萃取柱的性質(zhì)，選擇合適的上樣液對于凈化效果也是尤為重要的。在本發(fā)明所提供的關(guān)于l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖含量的檢測方法中，首先，在s1中，其通過利用水作為溶劑提取目標(biāo)物，因這幾種糖或糖醇可以充分溶解在水中，因此利用水提取可以充分將這幾種物質(zhì)提取，因此有利于提高最終檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性以及靈敏度。進(jìn)一步，加入乙腈混合，即乙腈與水共同作為目標(biāo)物的溶劑，即以s1最后得到的混合溶液(第一上清液和第一有機(jī)溶劑混合)作為利用固相萃取柱進(jìn)行凈化的上樣液。這里需說明的是，因為l-巖藻糖醇、海藻糖、棉籽糖的含量比較小，因此利用水提取后，相當(dāng)于溶劑基本為水，即第一上清液的主要物質(zhì)也是水，可近似看做第一上清液全為水，因此第二上清液作為固相萃取柱的上樣液，其溶劑水與乙腈的體積比相當(dāng)于10～30：70～90，即乙腈體積占比大概為70～90％。

6、而為什么選用溶劑水與乙腈的體積比約為10～30：70～90(即第一上清液與乙腈的體積比)作為氨基固相萃取柱的上樣液，這是因為，氨基固相萃取柱工作原理為氨基官能團(tuán)通過氫鍵和偶極-偶極相互作用實現(xiàn)保留目標(biāo)物，氫鍵作用會隨著水比例的增加而比較明顯的削弱，難以將目標(biāo)物保留在固相萃取柱中，所以高比例的水相不適合作為上樣液；乙腈由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不會與氨基基團(tuán)發(fā)生氫鍵作用，進(jìn)而影響目標(biāo)物的保留，所以乙腈適合作為上樣液。但是，由于目標(biāo)物易溶于水，不溶于乙腈，如果選擇純乙腈作為上樣液，將無法使目標(biāo)物溶解于溶劑中。綜上考慮，本發(fā)明選擇乙腈+水作為上樣液。但是，由于水相比例過高，會削弱氨基固相萃取柱的保留能力，水相比例過低，會使目標(biāo)物無法完全溶解。因此，本發(fā)明選用溶劑水與乙腈的體積比約為10～30：70～90作為上樣液(包含目標(biāo)物，目標(biāo)物含量低，可暫且忽略不計)，能夠兼顧目標(biāo)物的溶解性以及去除雜質(zhì)的作用，更有利于檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏性。

7、試樣經(jīng)過氨基固相萃取柱凈化后，目標(biāo)物會留在萃取柱內(nèi)，因此還需要對其進(jìn)行淋洗，將目標(biāo)物洗脫下來，洗脫溶劑應(yīng)具有足夠的極性和溶解度，以確保目標(biāo)物質(zhì)能夠從固相萃取柱中完全洗脫出來。本發(fā)明使用甲醇作為洗脫溶劑，能夠保證l-巖藻糖醇、海藻糖、以及棉籽糖具有較高的洗脫率，因此能夠進(jìn)一步保證后續(xù)的檢測結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性以及靈敏性。

8、在這里需要說明的是，因在檢測行業(yè)中，通常是取適當(dāng)?shù)臉悠方?jīng)過一定的提取步驟，因不同步驟中取樣量會有所變化，因此最終代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算得到的待測物含量不是對應(yīng)最初樣品的待測物含量，但是可以根據(jù)不同步驟中的取樣量變化，換算出最初樣品的待測物含量。本發(fā)明也是如此，在此針對換算過程就不一一展開了，這是本領(lǐng)域數(shù)據(jù)處理的常規(guī)操作，且本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以理解。

9、優(yōu)選地，在s1中，離心處理中，離心轉(zhuǎn)速為3500～4500r/min，離心時間為2～5min。離心處理控制一定的轉(zhuǎn)速，有利于充分提取目標(biāo)物，同時實現(xiàn)目標(biāo)物與雜質(zhì)良好的分離，還能夠防止目標(biāo)物受到損壞。

10、優(yōu)選地，在s1中，第一上清液與第一有機(jī)溶劑的體積比為20：80。

11、優(yōu)選地，在s1中，加入第一有機(jī)溶劑后，利用渦旋混合均勻，且進(jìn)行超聲8～15min。

12、優(yōu)選地，在s2中，依次利用第三有機(jī)溶劑、水對氨基固相萃取柱進(jìn)行活化，第三有機(jī)溶劑溶劑包括甲醇。依次選擇甲醇、水對氨基固相萃取柱進(jìn)行活化，既能有效去除柱內(nèi)的雜質(zhì)，又能調(diào)節(jié)柱子的極性，使萃取柱適用于本發(fā)明中的目標(biāo)物類型，在實際應(yīng)用中較為靈活，可以根據(jù)具體的分析物和樣品基質(zhì)調(diào)整甲醇和水的比例。

13、優(yōu)選地，在s2中，依次利用甲醇、水對氨基固相萃取柱進(jìn)行活化，且甲醇、水的體積比為8～20:8～20。進(jìn)一步地，甲醇、水以上述比例分別對氨基固相萃取柱進(jìn)行活化，更適用于本發(fā)明中幾種糖或糖醇的分析，即更有利于將本發(fā)明中目標(biāo)物固定在柱內(nèi)的同時，去除其他雜質(zhì)，因而更有利于后面進(jìn)一步的檢測分析，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏性。

14、優(yōu)選地，在s2中，將混合溶液移入已活化的氨基固相萃取柱后，還需在柱上液面為1.5～2.5mm處，加入混合溶劑，混合溶劑包括水、乙腈，且水、乙腈的體積比為10～30：70～90。進(jìn)一步地，在s1中得到的混合溶液全部移入氨基固相萃取柱后，繼續(xù)加入一定量的水、乙腈混合溶劑，有利于更加充分地將目標(biāo)化合物與雜質(zhì)分離開來，達(dá)到更好的去雜質(zhì)效果，而進(jìn)一步提高后續(xù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。

15、優(yōu)選地，在s2的混合溶劑中，水、乙腈的體積比為20:80。

16、優(yōu)選地，在s2中，氨基固相萃取柱包括cnwbond?nh2/si?spe。

17、優(yōu)選地，cnwbond?nh2/si?spe的柱規(guī)格為1g/10ml。

18、優(yōu)選地，在s2中，于45～55℃中利用惰性氣體去除洗脫液中的溶劑。優(yōu)選地，在s2中，于50℃中利用惰性氣體去除洗脫液中的溶劑。優(yōu)選地，惰性氣體包括氮氣、氬氣中的至少一種。

19、優(yōu)選地，在s2中，復(fù)溶過程中，采用的復(fù)溶液包括甲醇、水；且甲醇、水的體積比為80～92:8～20。不同的溶劑進(jìn)樣時會在出現(xiàn)因吸收值不同所導(dǎo)致的溶劑峰，且不同的溶劑對于目標(biāo)物的溶解度也不一致，因此，選擇合適的復(fù)溶液有利于兼顧目標(biāo)物的溶解度以及出峰質(zhì)量，進(jìn)而有利于保證檢測結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性以及靈敏性。而且本發(fā)明還采用了其他復(fù)溶劑如乙腈+水，但是在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，糖分過高會導(dǎo)致乙腈水分層，因此，若選擇乙腈水作為復(fù)溶液，本實驗方法僅適合檢測含糖量比較低的樣品。而使用甲醇+水作為復(fù)溶劑，能夠有更大范圍的檢測，既能有效溶解樣品，上機(jī)譜圖也未出現(xiàn)峰展寬、峰分叉現(xiàn)象，是較好的復(fù)溶液。

20、優(yōu)選地，在s2中，復(fù)溶過程中，采用的復(fù)溶液包括甲醇、水。

21、優(yōu)選地，在s2中，復(fù)溶過程中，采用的復(fù)溶液包括甲醇、水，甲醇、水的體積比為86:14。

22、優(yōu)選地，在s2中，采用0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過濾。

23、優(yōu)選地，在s3中，分別關(guān)于l-巖藻糖醇、海藻糖、以及棉籽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，對數(shù)回歸方程的相關(guān)系數(shù)皆不低于0.99。

24、優(yōu)選地，關(guān)于l-巖藻糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝2.0070.2538x1.34731475。優(yōu)選地，關(guān)于l-巖藻糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝y(tǒng)＝2.0070.2538x1.34731475，對數(shù)工作曲線范圍ρ為0.04～0.8mg/ml-1，相關(guān)系數(shù)為0.99929。

25、優(yōu)選地，關(guān)于海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝7589.02174x1.28211932。優(yōu)選地，關(guān)于海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝7589.02174x1.28211932，線性范圍為0.25～0.5mg/ml-1，相關(guān)系數(shù)為0.99966。

26、優(yōu)選地，關(guān)于棉籽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝y(tǒng)＝23436.582x?1.12890623。優(yōu)選地，關(guān)于棉籽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝23436.582x?1.12890623，線性范圍為0.05～1.0mg/ml-1，相關(guān)系數(shù)為0.99955。

27、優(yōu)選地，s3中制作關(guān)于l-巖藻糖醇、海藻糖、以及棉籽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的具體操作如下：

28、步驟1，配置關(guān)于l-巖藻糖醇、海藻糖、以及棉籽糖的不同標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，l-巖藻糖醇的濃度點包括0.04mg/ml、0.08mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml，海藻糖的濃度點包括0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml，棉籽糖的濃度點包括0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml；

29、步驟2，以測得目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)、對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)曲線為對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

30、優(yōu)選地，在s4中，高效液相色譜儀的色譜柱包括氨基色譜柱。選用該類型的色譜柱，相對于其他類型的色譜柱，可以更好的峰型和分離度，因此更有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。

31、優(yōu)選地，氨基色譜柱尺寸為4.6×250mm，填充劑(填料)粒徑5μm。

32、優(yōu)選地，在s4中，高效液相色譜儀的洗脫過程為梯度洗脫，洗脫過程中洗脫液包括流動相a和流動相b；流動相a為乙腈，流動相b為水，且具體洗脫程序如下：

33、 時間/min a/％ b/％ 0.00 86 14 6.00 88 12 25.00 88 12 30.00 80 20 38.00 80 20 39.00 86 14 40.00 86 14

34、選用梯度洗脫以及上述洗脫液、具體的洗脫程序，更有利于將目標(biāo)物l-巖藻糖醇、海藻糖以及棉籽糖進(jìn)行分離，因此有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性以及靈敏度。

35、優(yōu)選地，在s4中，高效液相色譜儀的進(jìn)樣量為15～30μl。優(yōu)選地，在s4中，高效液相色譜儀的進(jìn)樣量為20μl。

36、優(yōu)選地，高效液相色譜儀中色譜柱的柱溫為43～47℃。優(yōu)選地，高效液相色譜儀中色譜柱的柱溫為45℃。

37、優(yōu)選地，高效液相色譜儀中洗脫液的流速為0.8～1.2ml/min。優(yōu)選地，高效液相色譜儀中洗脫液的流速為1.0ml/min。

38、優(yōu)選地，高效液相色譜儀中蒸發(fā)光散射檢測器條件為，霧化器、漂移管溫度：62～67℃；氮氣流速1.4～1.8l/min。優(yōu)選地，高效液相色譜儀中蒸發(fā)光散射檢測器條件為，霧化器、漂移管溫度：65℃；氮氣流速1.6l/min。