本發(fā)明涉及t細胞受體，更具體地，涉及一種利用噬菌體展示技術篩選人鼠交叉mr1限制性高親和力tcr的方法。

背景技術：

1、mait(mucosal-associated?invariant?t)細胞是一類固有樣免疫細胞，具有保守的tcr(t?cell?antigen?receptor)庫，通常由恒定的tcrα鏈(va7.2-ja?33)與有限的tcrβ鏈庫配對組成，表現(xiàn)出結構上的保守性。mait細胞tcr能夠識別微生物代謝產(chǎn)物，如核黃素代謝中間產(chǎn)物5-op-ru呈遞給mhc-i相關蛋白1(mhc-class-i-related?protein?1mr1)。mait細胞在外周血、肝臟、肺和黏膜組織中富集，是黏膜屏障的主要免疫細胞之一；其具有快速應答的功能特性，無需克隆擴增即可通過分泌ifn-γ、tnf-α、il-17及顆粒酶b，在抗感染免疫、炎癥調節(jié)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。未來，針對mait細胞的功能調控可能為感染性疾病、炎癥性疾病和腫瘤的治療提供新思路，以及靶向mait細胞開發(fā)新型免疫療法。

2、噬菌體展示技術是一種體外選擇平臺，通過在噬菌體表面展示多肽或蛋白質來研究它們與目標分子的相互作用。其能夠利用噬菌體表面的外殼蛋白，將外源蛋白(如tcr)融合表達在噬菌體表面，同時保持噬菌體dna內部攜帶編碼該外源蛋白的基因。通過這種方法，可以實現(xiàn)表型和基因型之間的直接關聯(lián)，從而通過篩選特定結合能力的噬菌體顆?？焖侔l(fā)現(xiàn)目標分子。使用噬菌體展示短肽和抗體的成功導致該技術的發(fā)展。由于tcr在免疫治療中的廣泛應用，使其成為通過噬菌體展示開發(fā)的重要結合基序。盡管噬菌體展示已廣泛應用于抗體呈遞，但tcr是相對大且復雜的分子，使得在噬菌體表面上的呈遞具有挑戰(zhàn)性。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明利用噬菌體展示技術制備mait細胞單鏈t細胞受體(sctcr)噬菌體文庫，通過mr1/5-op-ru四聚體對sctcr噬菌體文庫進行生物淘選，phage-elisa鑒定出tcr6號克隆(tcr6)與人和鼠mr1/5-op-ru均有特異性結合且相對其他克隆親和力更高。

2、根據(jù)本發(fā)明的目的，提供了一種利用噬菌體展示技術篩選人鼠交叉mr1限制性高親和力tcr的方法，包括以下步驟：

3、(1)從外周血單個核細胞中分選出mait細胞，提取所述mait細胞的rna，通過rt-pcr擴增得到cdna；

4、第一輪pcr以所述cdna為模板，以traf-1為前向引物，trar-1為后向引物，擴增vα鏈片段；然后分別以trbf1-1、trbf2-1、trbf3-1、trbf4-1為前向引物，trbr-1為后向引物，分別擴增出4類vβ鏈片段；

5、第二輪pcr以所述vα為模板，以traf-2為前向引物，trar-2為后向引物，擴增vα-2鏈片段，分別以trbf1-2、trbf2-2、trbf3-2、trbf4-2為前向引物，trbr-2為后向引物，分別擴增出4類vβ-2鏈片段；

6、所述traf-1的序列如seq?id?no:1所示，所述trar-1的序列如seq?id?no:2所示，所述trbf1-1的序列如seq?id?no:3所示，所述trbf2-1的序列如seq?id?no:4所示，所述trbf3-1的序列如seq?id?no:5所示，所述trbf4-1的序列如seq?id?no:6所示，所述trbr-1的序列如seq?id?no:7所示，所述traf-2的序列如seq?id?no:8所示，所述trar-2的序列如seq?id?no:9所示，所述trbf1-2的序列如seq?id?no:10所示，所述trbf2-2的序列如seq?idno:11所示，所述trbf3-2的序列如seq?id?no:12所示，所述trbf4-2的序列如seq?id?no:13所示，所述trbr-2的序列如seq?id?no:14所示；

7、利用連接肽將所述vα-2鏈片段分別和各個所述vβ-2鏈片段組裝成完整的sctcr片段；

8、將線性化的噬菌粒載體pcomb3x分別和各個所述sctcr片段通過同源重組連接，構建重組噬菌粒載體pcomb3x-sctcr，并將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌中；然后利用輔助噬菌體m13k07進行再感染，獲得重組噬菌體，即得到sctcr文庫；

9、(2)將蛋白mr1與核黃素代謝中間產(chǎn)物5-op-ru形成的四聚體包被在固相載體上；然后將步驟(1)得到的重組噬菌體與所述固相載體進行孵育，棄去未結合的靶分子溶液，隨后用洗脫液對特異性結合的噬菌體進行洗脫，得到特異性洗脫物；將該特異性洗脫物進行培養(yǎng)，挑選邊緣清晰的單菌落，進行搖菌，提質粒酶切鑒定再進行測序；

10、(3)將鑒定的陽性單克隆制備成噬菌體溶液，并將噬菌體sctcr進行單克隆phage-elisa鑒定；分別包被人和鼠的蛋白mr1與核黃素代謝中間產(chǎn)物5-op-ru四聚體，加入待測的單個克隆噬菌體溶液，并以相同滴度輔助噬菌體m13k07為陰性對照，以多克隆混合噬菌體溶液作為陽性對照，加入辣根過氧化物酶標記anti-m13抗體，進行phage-elisa，在酶標儀中檢測波長在450nm處的吸光值；將od450值顯著高于陽性對照作為高親和力tcr，所述顯著為p<0.05，得到序列如seq?id?no:15所示的克隆具有顯著性差異，即序列如seq?id?no:15所示的tcr為人鼠mr1限制性高親和力tcr。

11、優(yōu)選地，步驟(1)中，所述分選的方法為磁珠分選。

12、優(yōu)選地，步驟(2)中，所述固相載體為硫酸鹽乳膠微球。

13、優(yōu)選地，步驟(2)中，所述四聚體為人的蛋白mr1與核黃素代謝中間產(chǎn)物5-op-ru四聚體。

14、優(yōu)選地，步驟(1)中，通過重疊延伸pcr法，將所述vα-2鏈片段分別和各個所述vβ-2鏈片段組裝成各個完整的sctcr片段。

15、優(yōu)選地，步驟(1)中，所述轉化為電穿孔轉化。

16、總體而言，通過本發(fā)明所構思的以上技術方案與現(xiàn)有技術相比，主要具備以下的技術優(yōu)點：

17、(1)本發(fā)明利用噬菌體展示技術制備mait細胞單鏈t細胞受體(sctcr)噬菌體文庫，通過mr1/5-op-ru四聚體對sctcr噬菌體文庫進行生物淘選，phage-elisa鑒定出tcr6號克隆(tcr6)與人和鼠mr1/5-op-ru均有特異性結合且相對其他克隆親和力更高。

18、(2)本發(fā)明中噬菌體文庫展示的tcr為單鏈tcr，可極大地提高展示效率。噬菌體文庫由編碼tcr的dna片段插入到噬菌體表達載體中構建而成，本發(fā)明將全長的tcrα鏈和β鏈設計成單鏈tcr(sctcr)，將tcr的α鏈和β鏈可變區(qū)(vα和vβ)通過一段柔性連接肽(富含甘氨酸和絲氨酸的15肽)連接，形成單鏈分子。這種格式具有較小的分子量(約32kda)，有助于提高展示效率。

19、(3)本發(fā)明可利用噬菌體展示技術構建mait細胞獨特的sctcr噬菌體文庫，通過多輪生物淘選篩選mait細胞單鏈tcr，在篩選結束后，利用噬菌體酶聯(lián)免疫吸附實驗(phage-elisa)驗證tcr與人以及小鼠的mr1-5-op/ru四聚體的特異性與親和力。

20、(4)本發(fā)明將mr1/5-op-ru四聚體包被在硫酸乳膠微球上作為固相載體，使得生物淘選的操作更為簡單易行。

21、(5)tcr6號噬菌體克隆對人和鼠的mr1/5-op-ru均有特異性及高親和力：經(jīng)過單克隆phage-elisa實驗驗證，生物淘選后的19個克隆中，tcr6號克隆對人和鼠的mr1四聚體均具有顯著的特異性以及高親和力。

22、(6)本發(fā)明具有可擴展性：該體系篩選出的mait細胞tcr既可以用人的mr1四聚體也可以用鼠的mr1四聚體進行鑒定，因此篩選出能同時識別人和鼠mr1的tcr6號克隆可以為mait細胞tcr-t細胞系、mait細胞tcr-t細胞治療以及mait細胞tcr轉基因小鼠的建立提供基礎。