本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體地，涉及一種用于識別有機磷酸酯的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、有機磷酸二酯（organophosphate?diesters，di-opes）在水體、沉積物、大氣等環(huán)境介質(zhì)及生物樣品內(nèi)被廣泛檢出，di-opes的一個主要來源是工業(yè)產(chǎn)品的直接使用或者tri-opes工業(yè)生產(chǎn)中的雜質(zhì)。

2、磷酸二苯酯、磷酸二丁酯、雙（2-乙基己基）磷酸酯等均是廣泛應(yīng)用的阻燃劑或增塑劑，年產(chǎn)量高達(dá)17050噸；此外，隨著多溴聯(lián)苯醚等有毒鹵代阻燃劑逐步淘汰，機磷酸三酯（organophosphate?triesters，tri-opes）在全球消費和生產(chǎn)中的需求急劇增加，生產(chǎn)量超250萬噸。tri-opes的大量使用使其廣泛存在于環(huán)境介質(zhì)中，而其通過生物或非生物轉(zhuǎn)化形成的產(chǎn)物是環(huán)境中di-opes的另一個重要來源，無處不在的di-opes對生物體的負(fù)面影響不容忽視。

3、毒理學(xué)研究表明，di-opes會對水生生物產(chǎn)生毒害作用，包括細(xì)胞毒性、發(fā)育毒性、致畸性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等；流行病學(xué)研究也揭示了di-opes對人體的潛在不良反應(yīng)，例孕婦尿液中di-opes的濃度水平和嬰兒生長發(fā)育異常以及神經(jīng)發(fā)育損傷等癥狀有關(guān)。更令人擔(dān)憂的是，與母體化合物tri-opes相比，部分di-opes會產(chǎn)生類似甚至更高的毒性效應(yīng)。因此識別環(huán)境中的有機磷酸二酯及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有重要意義。

4、基于高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜的篩查技術(shù)，使得在一次樣品運行中同時檢測數(shù)千種化合物成為可能，通過建立化合物庫，靶向篩查技術(shù)可以揭示高關(guān)注的二磷酸酯（di-opes）在各種環(huán)境介質(zhì)中的賦存情況，然而化合物庫涵蓋的di-opes種類和數(shù)量較少且覆蓋度有限。非靶向篩查技術(shù)通過挖掘保留時間、準(zhǔn)分子離子峰、特征碎片離子和同位素峰分布等分子特征信息，大大提高了未知di-opes及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定效率。但是環(huán)境中大量共存的干擾物質(zhì)使得化合物的結(jié)構(gòu)解析仍是一項耗時、艱難的任務(wù)。

5、因此，目前識別環(huán)境中的未知有機磷酸二酯及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物仍存在一定的挑戰(zhàn)性，同時復(fù)雜基質(zhì)中共存的大量干擾分子也極大地提高了數(shù)據(jù)處理的難度和耗時，而鑒于環(huán)境中存在的有機磷酸二酯分布廣、種類多、結(jié)構(gòu)各異等問題，發(fā)展一種快速、靈敏、經(jīng)濟、高通量有機磷酸二酯及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物識別篩查方法，有利于提升高風(fēng)險物質(zhì)的篩查效率。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種用于識別有機磷酸酯的方法及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一目的是提供氨基酸序列如seq?id?no：1所示的肽段在識別有機磷酸酯中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的第二目的是提供一種用于識別有機磷酸酯的方法。

4、本發(fā)明的第三目的是提供上述方法在識別有機磷酸酯中的應(yīng)用。

5、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實現(xiàn)的：

6、本發(fā)明請求保護(hù)氨基酸序列如seq?id?no：1所示的肽段在識別有機磷酸酯中的應(yīng)用。

7、肽段（seq?id?no：1）：ac-sgagkt-nh2；

8、其中氨基酸序列如seq?id?no：1所示的肽段的n端有乙?；揎?，c端有氨基修飾。

9、優(yōu)選地，所述有機磷酸酯為有機磷酸單酯和/或有機磷酸二酯。

10、更優(yōu)選地，所述有機磷酸單酯為磷酸-2-乙基己酯（ehp）、2-[1-[(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基)甲基]-2-甲基吡啶-1-鎓-3-基]乙基二氫磷酸酯（ptp）、4-氯-3-氟-4-氧代丁基二氫磷酸酯（cfobp）、3-（烯丙氧基）-2-苯氧基苯基二氫磷酸酯（apdp）和2-（氟甲基）-5-（4-甲基咪唑[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基）戊基二氫磷酸酯（fmpdp）；所述有機磷酸二酯為磷酸二丁酯（dbp）、磷酸二苯酯（dpp）、二（2-乙基己基）磷酸酯（dehp）、雙-（1-氯-2-丙基）磷酸酯（bcpp）、1-（9z-十八烯?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（pe（18:1（9z）0:0））、1-（9z-十六烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺pe（16:1（9z）/0:0）、1-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺lyso（pe（0:0/16:0）、苯基乙烯基氫磷酸酯（epp）和雙（5-羥基-4-氧代庚-6-烯-1-基）氫磷酸酯（bhohp）。

11、本發(fā)明還請求保護(hù)一種用于識別有機磷酸酯的方法，包括以下步驟：

12、s1.待測樣品預(yù)處理：對待測樣品依次進(jìn)行萃取和洗脫，收集洗脫液并干燥，接著溶解于對照溶液中，得到待測樣品提取液；所述對照溶液為甲醇或乙腈；

13、s2.將步驟s1得到的待測樣品提取液進(jìn)樣至高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜，高效液相色譜儀輸出的物質(zhì)通過三通接頭與氨基酸序列如seq?id?no：1所示的肽段溶液混合后進(jìn)樣至質(zhì)譜儀中進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到待測樣品質(zhì)譜結(jié)果；

14、將步驟s1得到的待測樣品提取液進(jìn)樣至高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜，高效液相色譜儀輸出的物質(zhì)通過三通接頭與步驟s1中所示對照溶液混合后進(jìn)樣至質(zhì)譜儀中進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到待測樣品對照質(zhì)譜結(jié)果；

15、s3.挑選步驟s2得到的待測樣品質(zhì)譜結(jié)果中相較于待測樣品對照質(zhì)譜結(jié)果顯著上調(diào)的特征峰，并挑選其中△m/z=560.2918的特征峰作為初篩特征峰；

16、s4.將步驟s3得到的初篩特征峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)而識別待測樣品中的有機磷酸酯。

17、優(yōu)選地，步驟s1中所述萃取為對待測樣品利用hlb固相萃取柱進(jìn)行萃取。

18、更優(yōu)選地，所述hlb固相萃取柱為利用對照溶液沖洗并利用去離子水平衡后的hlb固相萃取柱；所述對照溶液為甲醇或乙腈。

19、優(yōu)選地，步驟s1中所述洗脫為利用對照溶液進(jìn)行洗脫；所述對照溶液為甲醇或乙腈。

20、優(yōu)選地，所述高效液相色譜的色譜條件為：流速為200～400μl/min；柱溫為25～40℃；流動相梯度為：流動相b的起始梯度設(shè)置為10%，接著在10min內(nèi)升高至50%，接著在12min時升高至90%并維持3min，接著在15.1min時降低至10%，維持5min，其中流動相a為水，流動相b為乙腈。

21、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述色譜柱為poroshell?120?ec-c18色譜柱；色譜柱的規(guī)格為3.0×150mm，1.9μm。

22、優(yōu)選地，步驟s2中所述氨基酸序列如seq?id?no：1所示的肽段溶液以20μl/min的流速通過三通接頭與高效液相色譜儀輸出的物質(zhì)混合。

23、更優(yōu)選地，所述肽段溶液的濃度為50μmol/l。

24、優(yōu)選地，步驟s2中所述質(zhì)譜分析的條件為：

25、采用陰離子模式檢測，鞘氣溫度為100～400℃，鞘氣流速為5～11l/min，噴嘴電壓為1000～4000v，霧化氣壓力為5～50psi，干燥氣溫度為100～400℃，干燥氣流速為5～11l/min，毛細(xì)管電壓為2000～4000v，錐孔電壓為65v，八級桿電壓為750v，碎裂電壓為100～200v。

26、更優(yōu)選地，所述質(zhì)譜分析的條件為：

27、采用陰離子模式檢測，鞘氣溫度為400℃，鞘氣流速為11l/min，噴嘴電壓為1800v，霧化氣壓力為10psi，干燥氣溫度為250℃，干燥氣流速為11l/min，毛細(xì)管電壓為4000v，錐孔電壓為65v，八級桿電壓為750v，碎裂電壓為125v。

28、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述鞘氣為氮氣。

29、優(yōu)選地，步驟s2中所述質(zhì)譜分析為利用配備esi源的四級桿飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

30、優(yōu)選地，步驟s3挑選顯著上調(diào)的特征峰前，利用metaboanalyst對質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行缺失值填充。

31、更優(yōu)選地，所述缺失值填充具體為：使用缺失值對應(yīng)變量最小正值的1/5替換樣品缺失值。

32、優(yōu)選地，步驟s3中所述顯著上調(diào)的特征峰為上調(diào)且fold?change＞5.0且p-value＜0.05的特征峰。

33、優(yōu)選地，步驟s4中所述結(jié)構(gòu)鑒定具體為通過二級譜圖數(shù)據(jù)庫檢索、利用sirius軟件預(yù)測和標(biāo)準(zhǔn)品驗證鑒定；所述標(biāo)準(zhǔn)品為磷酸二丁酯（dbp）、磷酸二苯酯（dpp）、二（2-乙基己基）磷酸酯（dehp）、雙-（1-氯-2-丙基）磷酸酯（bcpp）、1-（9z-十八烯?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（pe（18:1（9z）0:0））、磷酸-2-乙基己酯（ehp）的分析純級別試劑。

34、本發(fā)明還請求保護(hù)上述任一所述的方法在識別有機磷酸酯中的應(yīng)用。

35、優(yōu)選地，所述有機磷酸酯為有機磷酸單酯和/或有機磷酸二酯。

36、更優(yōu)選地，所述有機磷酸單酯為磷酸-2-乙基己酯（ehp）、2-[1-[(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基)甲基]-2-甲基吡啶-1-鎓-3-基]乙基二氫磷酸酯（ptp）、4-氯-3-氟-4-氧代丁基二氫磷酸酯（cfobp）、3-（烯丙氧基）-2-苯氧基苯基二氫磷酸酯（apdp）和2-（氟甲基）-5-（4-甲基咪唑[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基）戊基二氫磷酸酯（fmpdp）；所述有機磷酸二酯為磷酸二丁酯（dbp）、磷酸二苯酯（dpp）、二（2-乙基己基）磷酸酯（dehp）、雙-（1-氯-2-丙基）磷酸酯（bcpp）、1-（9z-十八烯?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（pe（18:1（9z）0:0））、1-（9z-十六烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺pe（16:1（9z）/0:0）、1-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺lyso（pe（0:0/16:0）、苯基乙烯基氫磷酸酯（epp）和雙（5-羥基-4-氧代庚-6-烯-1-基）氫磷酸酯（bhohp）。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

38、本發(fā)明提供了氨基酸序列如seq?id?no：1所示的肽段在識別有機磷酸酯中的應(yīng)用，并提供了一種用于識別有機磷酸酯的方法，所述方法通過對待測樣品預(yù)處理后，經(jīng)過高效液相色譜后與氨基酸序列如seq?id?no：1所示的肽段混合后進(jìn)行質(zhì)譜，得到待測樣品質(zhì)譜結(jié)果，同時設(shè)置對照組并得到待測樣品對照質(zhì)譜結(jié)果，基于質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析并挑選待測樣品質(zhì)譜結(jié)果中顯著上調(diào)且滿足△m/z=560.2918的特征峰作為初篩特征峰，將初篩特征峰結(jié)合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，進(jìn)而識別有機磷酸酯。利用本發(fā)明所示方法能夠?qū)Υ郎y樣品中的有機磷酸酯準(zhǔn)確識別，避免了待測樣品中大量未知物質(zhì)的干擾。