本發(fā)明通常涉及生物技術(shù)，尤其涉及基因表達(dá)調(diào)控、基因治療和醫(yī)藥。更具體地，本文公開了工程化的肝臟特異性增強(qiáng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、重組aav(raav)載體通常通過用目的基因替換腺相關(guān)病毒(aav)的病毒編碼序列來產(chǎn)生。raav載體被認(rèn)為是最有希望治療遺傳性疾病的病毒載體。然而，raav的包裝容量有限，小于5.0kb。如果目的基因的大小大于5.0kb，raav載體就無法完全包裝在aav衣殼中，因此無法有效的用于基因治療。
2、raav載體通常由治療基因的表達(dá)盒和兩個(gè)itr組成。表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、目的基因(轉(zhuǎn)基因)和polya序列。目前可用的最短多聚腺苷酸序列約為50bp。兩個(gè)itr位于表達(dá)盒的兩端，每個(gè)itr長145bp，它們是必須摻入raav載體中的包裝信號(hào)。因此，治療基因表達(dá)盒的長度空間約為4.71kb。
3、一些編碼治療基因的dna片段對于raav包裝能力而言尺寸過大。為了使表達(dá)盒保持在有效包裝的范圍內(nèi)，啟動(dòng)子的小尺寸很重要。此外，如果啟動(dòng)子是肝臟特異性的并能驅(qū)動(dòng)較強(qiáng)的基因表達(dá)，這可以確保治療的安全性和效率，因?yàn)榇罅孔⑸鋜aav載體可能會(huì)導(dǎo)致不良的免疫反應(yīng)。從這個(gè)意義上說，人們迫切需要短的、強(qiáng)的肝臟特異性啟動(dòng)子，用于血友病a的raav基因治療。
4、另外，雖然一些編碼治療基因的dna片段足夠小以進(jìn)行有效包裝，但相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性較低，因此需要將大量的raav載體注射到患者體內(nèi)以產(chǎn)生足夠的相應(yīng)蛋白質(zhì)。大量注射raav載體可能會(huì)導(dǎo)致不良的免疫反應(yīng)。因此，需要開發(fā)有效的特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來增強(qiáng)治療基因的活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供了工程化的肝臟特異性增強(qiáng)子、包括該增強(qiáng)子的合成啟動(dòng)子、含有該合成啟動(dòng)子的表達(dá)載體、以及使用其來滿足本領(lǐng)域的需要，例如治療各種遺傳疾病或病癥。
2、一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的dna結(jié)合位點(diǎn)的工程化增強(qiáng)子，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由hnf-4α、hnf-3β、d位點(diǎn)結(jié)合蛋白(dbp)、ccaat增強(qiáng)子結(jié)合蛋白alpha/beta(c/ebp-α/β)和肝細(xì)胞核因子1alpha/beta(hnf-1α/β)。
3、在一些實(shí)施方案中，hnf-4α、hnf-3β、dbp、c/ebp-α/β和hnf-1α/β的dna結(jié)合位點(diǎn)分別包含seq?id?no:4-8的核苷酸序列。
4、在一些實(shí)施方案中，工程化的增強(qiáng)子包含seq?id?no:3、seq?id?no:9、seq?id?no:12的核酸序列，或核酸序列與seq?id?no:3、9或12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
5、另一方面，本發(fā)明提供了包含本文公開的工程化增強(qiáng)子和核心啟動(dòng)子的核酸序列的合成啟動(dòng)子。
6、在一些實(shí)施方案中，核心啟動(dòng)子是肝臟特異性啟動(dòng)子。
7、在一些實(shí)施方案中，肝臟特異性啟動(dòng)子是人α-1抗胰蛋白酶(haat)啟動(dòng)子。
8、在一些實(shí)施方案中，人α-1抗胰蛋白酶(haat)啟動(dòng)子包含seq?id?no:1、seq?idno:2的核酸序列，或與seq?id?no：1或2的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
9、在一些實(shí)施方案中，合成啟動(dòng)子包含seq?id?no:10、seq?id?no:13、seq?id?no:14，或核酸序列與seq?id?no：10、13或14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
10、另一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含本文公開的合成啟動(dòng)子可操作地連接至目的基因。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體是質(zhì)粒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體或重組腺相關(guān)病毒載體(raav)。
11、另一方面，本發(fā)明提供了治療有需要的受試者的遺傳疾病或病癥的方法，包括向受試者施用本文公開的表達(dá)載體，從而在受試者的肝臟中表達(dá)治療性蛋白。
12、在一些實(shí)施方案中，受試者是哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，受試者是人類。
13、在一些實(shí)施方案中，與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥選自包括但不限于遺傳性膽汁淤積癥、a型血友病、b型血友病、苯丙酮尿癥、遺傳性血色素沉著病、1型酪氨酸血癥、α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、精氨基琥珀酸尿癥、肝癌、糖原貯積病、尿素循環(huán)障礙、克里格勒-納賈爾綜合征、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、非典型溶血性尿毒癥綜合征-1、原發(fā)性高草酸尿癥1型、楓糖漿尿病、急性間歇性卟啉癥、凝血缺陷、糖原累積病1a型、純合子家族性高膽固醇血癥、有機(jī)酸尿癥、囊性纖維化、紅細(xì)胞生成性原卟啉癥、戈謝病、家族性高膽固醇血癥、鳥氨酸和轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥。
14、另一方面，本發(fā)明提供工程化增強(qiáng)子、或合成啟動(dòng)子、或表達(dá)載體在增強(qiáng)肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平中的用途。
15、另一方面，本發(fā)明提供工程化增強(qiáng)子、或合成啟動(dòng)子、或表達(dá)載體、或藥物組合物在制備用于與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥的藥物中的用途。
16、另一方面，本發(fā)明提供了包含本文所公開的工程化增強(qiáng)子、或合成啟動(dòng)子、或表達(dá)載體、或藥物組合物的試劑盒。
17、在一些實(shí)施例中，試劑盒還包含使用試劑盒的說明書。
18、參考以下描述和所附權(quán)利要求將更好地理解本發(fā)明的這些和其他特征、方面和優(yōu)點(diǎn)。
1.一種工程化增強(qiáng)子，其包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的dna結(jié)合位點(diǎn)，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由hnf-4α、hnf-3β、d位點(diǎn)結(jié)合蛋白(dbp)、ccaat增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α/β(c/ebp-α/β)和肝細(xì)胞核因子1α/β(hnf-1α/β)組成的組。
2.如權(quán)利要求1所述的工程化增強(qiáng)子，其中hnf-4α、hnf-3β、dbp、c/ebp-α/β和hnf-1α/β的dna結(jié)合位點(diǎn)分別包含seq?id?no：4-8的核酸序列。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的工程化增強(qiáng)子，其中所述工程化增強(qiáng)子包含與seq?idno：3、9或12的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。
4.一種合成啟動(dòng)子，其包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的工程化增強(qiáng)子和核心啟動(dòng)子的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成啟動(dòng)子，其中所述核心啟動(dòng)子是肝臟特異性啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的合成啟動(dòng)子，其中所述肝臟特異性啟動(dòng)子是人α-1抗胰蛋白酶(haat)啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的合成啟動(dòng)子，其中所述人α-1抗胰蛋白酶(haat)啟動(dòng)子包含與seq?id?no：1或2的核酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的合成啟動(dòng)子，其中所述合成啟動(dòng)子包含與seq?idno:10、13或14的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
9.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的合成啟動(dòng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體，其還包含可操作地連接到權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的合成啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼用于治療與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥的治療性蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的表達(dá)載體，其中所述治療性蛋白是fⅷ蛋白或其功能片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體是質(zhì)粒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體或重組腺相關(guān)病毒載體(raav)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體是raav載體。
15.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的工程化增強(qiáng)子、或權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的合成啟動(dòng)子、或權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
16.一種治療有需要的受試者的與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求15所述的藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述受試者是人類。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥選自包括但不限于遺傳性膽汁淤積癥、a型血友病、b型血友病、苯丙酮尿癥、遺傳性血色素沉著病、1型酪氨酸血癥、α-1型抗胰蛋白酶缺乏癥、精氨酸琥珀酸尿癥、肝癌、糖原貯積癥、尿素循環(huán)障礙、克里格勒-納賈爾綜合征、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、非典型溶血性尿毒癥綜合征-1、原發(fā)性高草酸尿癥1型、楓糖漿尿病、急性間歇性卟啉癥、凝血缺陷、糖原累積病a型、純合子家族性高膽固醇血癥、有機(jī)酸尿癥、囊性纖維化、紅細(xì)胞生成性原卟啉癥、戈謝病、家族性高膽固醇血癥、鳥氨酸和轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的工程化增強(qiáng)子、或權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的合成啟動(dòng)子、或權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的表達(dá)載體在增強(qiáng)肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因與所述合成啟動(dòng)子可操作地連接。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的工程化增強(qiáng)子、或權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的合成啟動(dòng)子、或權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的表達(dá)載體、或權(quán)利要求15的藥物組合物在制備用于與肝臟相關(guān)的遺傳性疾病或病癥的藥物中的用途。
22.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的合成啟動(dòng)子、或權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體、或權(quán)利要求15所述的藥物組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括使用所述試劑盒的說明書。