本發(fā)明屬于基因與酶工程，具體涉及一種多酶催化合成制備牛磺酸的方法。
背景技術(shù)：
1、?；撬?taurine)是一種重要的β-含硫氨基酸，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞中，是人類和動(dòng)物的條件性必需氨基酸。?；撬嵩谏矬w內(nèi)具有多種生理功能，包括膽鹽合成、鈣調(diào)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)抑制等，對(duì)視力、血小板聚集和胰島素的作用也至關(guān)重要。牛磺酸的合成主要來源于含硫氨基酸——胱氨酸，其生物合成途徑在肝臟、腎臟、白色和棕色脂肪組織、松果體和視網(wǎng)膜等多個(gè)組織中均有記錄。
2、?；撬岬暮铣芍饕ㄟ^兩條途徑：?；撬嵬緩胶蛠喤；撬嵬緩健Ｔ谂；撬嵬緩街校腚装彼崾紫缺话腚装彼犭p加氧酶(或半胱氨酸氧化酶，以下簡(jiǎn)稱“cdo”)氧化生成半胱氨酸亞磺酸(以下簡(jiǎn)稱“csa”)，csa進(jìn)一步被cdo氧化生成?；撬?，最后由半胱氨酸亞磺酸脫羧酶(以下簡(jiǎn)稱“csd”)脫羧生成牛磺酸。在亞?；撬嵬緩街校琧sa被csd脫羧生成亞?；撬?，亞?；撬犭S后被nad+依賴的含黃素單加氧酶1氧化生成?；撬?。在肝臟細(xì)胞液中，胱氨酸(cys)可被迅速氧化為3-磺?；彼?，該反應(yīng)由特定酶催化。3-磺?；彼崾且粋€(gè)代謝分支點(diǎn)，它可以非酶促氧化生成l-半胱氨酸，也可以進(jìn)入線粒體轉(zhuǎn)化為3-磺酰基-丙酮酸，或者在細(xì)胞質(zhì)中被脫羧生成亞?；撬帷喤；撬嵩诟闻K和大腦中以低濃度存在，且至少90％的亞?；撬峥杀贿M(jìn)一步氧化為?；撬帷?/p>
3、目前，?；撬岬纳a(chǎn)工藝主要包括化學(xué)合成法和酶法合成法?；瘜W(xué)合成法通常包括兩種：①以乙醇胺為原料，經(jīng)硫酸酯化，亞硫酸鈉還原得到?；撬幔嬖邗セ煌耆?，硫酸鈉分離困難，影響產(chǎn)品收率和質(zhì)量等缺點(diǎn)；②以環(huán)氧乙烷為原料，先與亞硫酸鈉開環(huán)加成，然后在加熱加壓條件下與氨反應(yīng)合成?；撬?，但氨化反應(yīng)需要高溫高壓，導(dǎo)致設(shè)備投資大，且氨化的收率也低，需多次循環(huán)氨化，增大了成本。近年來，酶法合成?；撬嶂饾u受到關(guān)注，其具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。然而，現(xiàn)有的酶法合成工藝仍存在效率不高、成本較高等問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、(一)發(fā)明目的
2、本發(fā)明的目的是提供一種多酶催化合成制備牛磺酸的方法，該制備方法提供了綠色、高效的?；撬狍w外制備途徑，具有反應(yīng)效率高，反應(yīng)時(shí)間短且成本較低。
3、(二)技術(shù)方案
4、為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種多酶催化合成制備?；撬岬姆椒ǎǎ?/p>
5、s1，分別將編碼半胱氨酸雙加氧酶、半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和含黃素單加氧酶1的基因克隆到載體pet-28a中，得到各個(gè)酶對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒。包括：分別對(duì)編碼半胱氨酸雙加氧酶、半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和含黃素單加氧酶1的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化后的目的基因分別克隆到載體pet-28a中，得到各個(gè)酶對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒。
6、s2，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到各個(gè)酶對(duì)應(yīng)的重組菌株；
7、s3，將所述重組菌株進(jìn)行繁殖培養(yǎng)至其od600值為0.6～0.8后，加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后離心收集菌體，再加入緩沖溶液重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞，離心、純化后分別得到重組半胱氨酸雙加氧酶、重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和重組含黃素單加氧酶1；
8、s4，以半胱氨酸為底物，利用重組半胱氨酸雙加氧酶、重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和重組含黃素單加氧酶1聯(lián)合進(jìn)行催化反應(yīng)，制備得到?；撬帷?/p>
9、進(jìn)一步地，所述編碼半胱氨酸雙加氧酶來源于人類、貪銅菌屬、芽孢桿菌屬或小鼠，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別如seq?id?no.1～4所示。
10、進(jìn)一步地，所述編碼半胱氨酸亞磺酸脫羧酶的基因來源于褐家鼠，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。
11、進(jìn)一步地，所述編碼含黃素單加氧酶1來源于智人，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如seq?idno.6所示。
12、進(jìn)一步地，所述s3步驟中，iptg濃度為0.2～0.6mm，優(yōu)選0.2mm，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為22～27℃，優(yōu)選為25℃，培養(yǎng)時(shí)間為8～16小時(shí)，優(yōu)選為12小時(shí)。
13、進(jìn)一步地，所述重組半胱氨酸雙加氧酶為19～22kda，所述重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶為55kda，所述重組含黃素單加氧酶1為60kda。
14、進(jìn)一步地，所述s4步驟中，各個(gè)酶的加入順序?yàn)椋褐亟M半胱氨酸雙加氧酶→重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶→重組含黃素單加氧酶1。
15、進(jìn)一步地，所述s4步驟的催化反應(yīng)體系中包括0.5～1ml?ph?7.0-9.0的緩沖液，0.1～1mg/ml的重組半胱氨酸雙加氧酶，0.1～1mg/ml的重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶，0.1～1mg/ml的重組含黃素單加氧酶1，1～50mm的半胱氨酸，其中ph?7.0-9.0的緩沖液優(yōu)選為1ml。
16、進(jìn)一步地，所述s4步驟的催化反應(yīng)體系還包括：1～5mm?fe2+和0.01～0.1mm的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
17、進(jìn)一步地，所述催化反應(yīng)中控制反應(yīng)溫度為10～50℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～10小時(shí)。
18、進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、乳酸菌和枯草芽孢桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌。
19、(三)有益效果
20、本發(fā)明的上述技術(shù)方案具有如下有益的技術(shù)效果：本發(fā)明提供了一種多酶催化合成制備牛磺酸的方法，為一種高效、環(huán)境友好、安全性高、高選擇性和高特異性、體外制備牛磺酸的新方法，該方法利用半胱氨酸雙加氧酶、半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和含黃素單加氧酶1反應(yīng)聯(lián)合高效制備?；撬幔仁菢?gòu)建重組質(zhì)粒，對(duì)編碼半胱氨酸雙加氧酶、半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和含黃素單加氧酶1的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化后的目的基因進(jìn)行重組，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞繁殖培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化后分別得到重組半胱氨酸雙加氧酶、重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和重組含黃素單加氧酶1，最后以半胱氨酸為底物，利用重組半胱氨酸雙加氧酶、重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和重組含黃素單加氧酶1聯(lián)合進(jìn)行催化反應(yīng)，獲得牛磺酸，采用本發(fā)明制備方法使得?；撬岬纳陕蕿?0％-80％。本發(fā)明提供了一種綠色高效、環(huán)保溫和的牛磺酸體外制備途徑，與化學(xué)合成法相比，多酶合成法具有以下優(yōu)勢(shì)：①環(huán)境友好：反應(yīng)條件溫和，無需強(qiáng)酸強(qiáng)堿，減少廢水和污染物。②產(chǎn)品純度高：反應(yīng)選擇性強(qiáng)，雜質(zhì)少，無需復(fù)雜的提純。③能耗低：常溫常壓下進(jìn)行反應(yīng)，無需高溫高壓，降低能耗。④安全性高：反應(yīng)過程不涉及有毒化學(xué)品，避免安全風(fēng)險(xiǎn)。⑤成本低：酶可回收利用，減少副產(chǎn)物處理成本。
1.一種多酶催化合成制備?；撬岬姆椒?，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多酶催化合成制備?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述編碼半胱氨酸雙加氧酶的基因來源于人類、貪銅菌屬、芽孢桿菌屬或小鼠，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別如seq?id?no.1～4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多酶催化合成制備?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述編碼半胱氨酸亞磺酸脫羧酶的基因來源于褐家鼠，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多酶催化合成制備?；撬岬姆椒ǎ涮卣髟谟?，所述編碼含黃素單加氧酶1的基因來源于智人，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如seq?id?no.6所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多酶催化合成制備牛磺酸的方法，其特征在于，所述s3步驟中，iptg濃度為0.2～0.6mm，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為22～27℃，培養(yǎng)時(shí)間為8～16小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多酶催化合成制備牛磺酸的方法，其特征在于，所述重組半胱氨酸雙加氧酶為19～22kda，所述重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶為55kda，所述重組含黃素單加氧酶1為60kda。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多酶催化合成制備牛磺酸的方法，其特征在于，所述s4步驟中，各個(gè)酶的加入順序?yàn)椋褐亟M半胱氨酸雙加氧酶→重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶→重組含黃素單加氧酶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多酶催化合成制備牛磺酸的方法，其特征在于，所述s4步驟的催化反應(yīng)體系包括：0.5～1ml?ph?7.0～9.0的緩沖液，0.1～1mg/ml的重組半胱氨酸雙加氧酶，0.1～1mg/ml的重組半胱氨酸亞磺酸脫羧酶，0.1～1mg/ml的重組含黃素單加氧酶1，1～50mm的半胱氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多酶催化合成制備?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述s4步驟的催化反應(yīng)體系還包括：1～5mm?fe2+和0.01～0.1mm的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多酶催化合成制備?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述催化反應(yīng)中控制反應(yīng)溫度為10～50℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～16小時(shí)。