本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種qpcr法醫(yī)學(xué)人類dna檢測的復(fù)合擴(kuò)增體系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、現(xiàn)代dna（deoxyribonucleic?acid，脫氧核糖核酸）檢測技術(shù)已成為現(xiàn)代法庭科學(xué)領(lǐng)域最為重要的技術(shù)手段之一，是處置各類案件、重特大事故及自然災(zāi)害等重大事件中最有效的個(gè)體識(shí)別工具。法醫(yī)dna分析一般包括樣本采集、dna提取、dna定量、pcr擴(kuò)增和基因分型、結(jié)果分析及比對(duì)幾個(gè)步驟。其中dna定量及質(zhì)量評(píng)估是dna分析過程的關(guān)鍵步驟，也是后續(xù)進(jìn)行pcr擴(kuò)增和分型檢測的基礎(chǔ)，是檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性的保障。而在法醫(yī)實(shí)踐中經(jīng)常需要應(yīng)對(duì)各種疑難降解樣本，這些生物檢材中的dna分子因暴露在惡劣環(huán)境中受多種物理、化學(xué)、生物因素影響，易發(fā)生降解而斷裂成為小片段分子，一些樣本還表現(xiàn)pcr抑制劑增加，導(dǎo)致檢出率大幅度降低。采用分光光度計(jì)等常規(guī)dna定量方法無法準(zhǔn)確定量法醫(yī)實(shí)踐中復(fù)雜的生物檢材，也無法評(píng)估樣本dna的質(zhì)量，所以需要一款簡便、高效的法醫(yī)學(xué)dna定量試劑盒。該試劑盒應(yīng)當(dāng)具有較大的檢測范圍，能夠準(zhǔn)確測定常量和痕量dna樣本的濃度；可以判定樣本中是否含有干擾pcr過程的抑制物，抑制程度如何；樣本dna是否降解，降解程度如何；能夠區(qū)分男性和女性dna并給出混合樣本中的男女dna比例。
2、因而急需一款適配str試劑盒的高靈敏度、高穩(wěn)定性且操作簡便的人類dna定量檢測技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、鑒于目前法醫(yī)試劑盒存在的適配度問題，采購流程復(fù)雜，價(jià)格高昂，本發(fā)明提供一種qpcr法醫(yī)學(xué)人類dna檢測的復(fù)合擴(kuò)增體系及其應(yīng)用，通過qpcr同時(shí)擴(kuò)增hs、hl、hy及ipc四個(gè)靶標(biāo)能夠用于法醫(yī)人類dna樣本的定量和質(zhì)量判斷，準(zhǔn)確性更好，靈敏性更高，適配str分型檢測試劑盒。
2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的實(shí)施例采用如下技術(shù)方案：
3、一種qpcr法醫(yī)學(xué)人類dna檢測的復(fù)合擴(kuò)增體系，復(fù)合擴(kuò)增體系通過qpcr同時(shí)擴(kuò)增hs、hl、hy及ipc四個(gè)靶標(biāo)，其中hs靶標(biāo)用于總dna定量，hl靶標(biāo)用于降解度評(píng)估，hy靶標(biāo)用于性別比例判斷，ipc靶標(biāo)用于抑制物檢測。
4、優(yōu)選地，hs靶標(biāo)為常染色體的多拷貝小片段擴(kuò)增子，其序列為seq?id?no.1；hl靶標(biāo)為常染色體的多拷貝大片段擴(kuò)增子，其序列為seq?id?no.2；hy靶標(biāo)為y染色體的多拷貝擴(kuò)增子，其序列為seq?id?no.3；ipc靶標(biāo)為自然界中未發(fā)現(xiàn)的合成序列靶標(biāo)，其序列為seqid?no.4。
5、優(yōu)選地，擴(kuò)增hs靶標(biāo)的上下游引物序列如seq?id?no.5-6所示；擴(kuò)增hl靶標(biāo)的上下游引物序列如seq?id?no.7-8所示；擴(kuò)增hy靶標(biāo)的上下游引物序列如seq?id?no.9-10所示；擴(kuò)增ipc靶標(biāo)的上下游引物序列如seq?id?no.11-12所示。
6、優(yōu)選地，標(biāo)記hs靶標(biāo)的探針序列如seq?id?no.13所示；標(biāo)記hl靶標(biāo)的探針序列如seq?id?no.14所示；標(biāo)記hy靶標(biāo)的探針序列如seq?id?no.15所示；標(biāo)記ipc靶標(biāo)的探針序列如seq?id?no.16所示。
7、本發(fā)明所述的序列如下表所示：
8、
9、優(yōu)選地，標(biāo)記hs靶標(biāo)的探針5’熒光標(biāo)記為vic，3’熒光標(biāo)記為bhq1；標(biāo)記hl靶標(biāo)的探針5’熒光標(biāo)記為cy5，3’熒光標(biāo)記為bhq2；標(biāo)記hy靶標(biāo)的探針5’熒光標(biāo)記為fam，3’熒光標(biāo)記為bhq1；標(biāo)記ipc靶標(biāo)的探針5’熒光標(biāo)記為tamra，3’熒光標(biāo)記為bhq2。
10、優(yōu)選地，復(fù)合擴(kuò)增體系中還加入了rox染料用于qpcr儀矯正。
11、一種qpcr法醫(yī)學(xué)人類dna定量試劑盒，包括上述的復(fù)合擴(kuò)增體系。
12、優(yōu)選地，試劑盒還包括pcr擴(kuò)增mix和dna定量標(biāo)準(zhǔn)品。
13、優(yōu)選地，試劑盒使用方法如下：
14、對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋；
15、使用引物探針混合物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和法醫(yī)dna樣本進(jìn)行多重?zé)晒鈖cr檢測；
16、根據(jù)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣本的ct值轉(zhuǎn)換為dna濃度，根據(jù)常染色體的多拷貝小片段hs確定樣本中人類dna總量，根據(jù)y染色體的多拷貝片段hy確定樣本中男性dna含量（女性dna測得值為0，男性dna測得值與hs差異不大，混合樣本可能有較大差異），根據(jù)hs與hy差值確定樣本中女性dna含量，根據(jù)降解指數(shù)di=hs/hl評(píng)價(jià)樣本降解程度，根據(jù)樣本ipc靶點(diǎn)ct值與標(biāo)準(zhǔn)品ipc靶點(diǎn)ct值之差同時(shí)結(jié)合靶點(diǎn)擴(kuò)增情況評(píng)價(jià)樣本中抑制劑的含量。
17、上述復(fù)合擴(kuò)增體系，或上述試劑盒在法醫(yī)dna樣本定量和樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。
18、本發(fā)明實(shí)施的優(yōu)點(diǎn)：
19、1.本發(fā)明可以利用qpcr擴(kuò)增檢測hs、hl、hy和ipc四個(gè)靶點(diǎn)，從而對(duì)法醫(yī)學(xué)人類dna進(jìn)行定量和質(zhì)量分析，操作簡便。
20、2.本發(fā)明具有較好的抗抑制劑能力，模板適應(yīng)范圍廣，適用于所有涉及有細(xì)胞的物證案件中的法醫(yī)dna定量。凡是含有細(xì)胞的生物檢材，如口腔拭子、血跡、精斑、唾液、毛發(fā)及其它人體組織等均能進(jìn)行dna定量。
21、3.本發(fā)明試劑盒靈敏度高，在實(shí)際案例中最低檢出1pg/μl的模板量；特異性好，常見哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類及微生物dna對(duì)體系均無干擾。
22、4.本發(fā)明試劑盒能夠準(zhǔn)確定量男女性dna的含量，在男女dna比例達(dá)到1：4000時(shí)仍然能夠準(zhǔn)確定量男性dna含量。
23、5.本發(fā)明試劑盒能夠準(zhǔn)確反映dna的降解程度，hl靶點(diǎn)特異性擴(kuò)增常染色體的大片段（240bp），能夠判定dna的降解程度，指導(dǎo)是否需要使用mini?str試劑盒。
24、6.本發(fā)明試劑盒可以準(zhǔn)確判斷樣本中的pcr抑制劑的情況，根據(jù)人工合成的ipc靶點(diǎn)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的ct值變化，可以明確樣本中是否含有pcr抑制劑，指導(dǎo)是否需要對(duì)樣本進(jìn)行純化處理。
25、7.本發(fā)明試劑盒能夠準(zhǔn)確定量口腔拭子、血跡、精斑、唾液、毛發(fā)等各類生物檢材的dna含量，指導(dǎo)后續(xù)str分型試劑盒的使用。
1.一種qpcr法醫(yī)學(xué)人類dna檢測的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于，所述復(fù)合擴(kuò)增體系通過qpcr同時(shí)擴(kuò)增hs、hl、hy及ipc四個(gè)靶標(biāo)，其中hs靶標(biāo)用于總dna定量，hl靶標(biāo)用于降解度評(píng)估，hy靶標(biāo)用于性別比例判斷，ipc靶標(biāo)用于抑制物檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于，所述hs靶標(biāo)為常染色體的多拷貝小片段擴(kuò)增子，其序列為seq?id?no.1；所述hl靶標(biāo)為常染色體的多拷貝大片段擴(kuò)增子，其序列為seq?id?no.2；所述hy靶標(biāo)為y染色體的多拷貝擴(kuò)增子，其序列為seq?id?no.3；所述ipc靶標(biāo)為自然界中未發(fā)現(xiàn)的合成序列靶標(biāo)，其序列為seq?id?no.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于，擴(kuò)增所述hs靶標(biāo)的上下游引物序列如seq?id?no.5-6所示；擴(kuò)增所述hl靶標(biāo)的上下游引物序列如seq?id?no.7-8所示；擴(kuò)增所述hy靶標(biāo)的上下游引物序列如seq?id?no.9-10所示；擴(kuò)增所述ipc靶標(biāo)的上下游引物序列如seq?id?no.11-12所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于，標(biāo)記hs靶標(biāo)的探針序列如seq?idno.13所示；標(biāo)記hl靶標(biāo)的探針序列如seq?id?no.14所示；標(biāo)記hy靶標(biāo)的探針序列如seq?idno.15所示；標(biāo)記ipc靶標(biāo)的探針序列如seq?id?no.15所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于，所述標(biāo)記hs靶標(biāo)的探針5’熒光標(biāo)記為vic，3’熒光標(biāo)記為bhq1；標(biāo)記hl靶標(biāo)的探針5’熒光標(biāo)記為cy5，3’熒光標(biāo)記為bhq2；標(biāo)記hy靶標(biāo)的探針5’熒光標(biāo)記為fam，3’熒光標(biāo)記為bhq1；標(biāo)記ipc靶標(biāo)的探針5’熒光標(biāo)記為tamra，3’熒光標(biāo)記為bhq2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于，所述復(fù)合擴(kuò)增體系中還加入了rox染料用于qpcr儀矯正。
7.一種qpcr法醫(yī)學(xué)人類dna定量試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的復(fù)合擴(kuò)增體系。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括pcr擴(kuò)增mix和dna定量標(biāo)準(zhǔn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用方法如下：
10.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的復(fù)合擴(kuò)增體系，或權(quán)利要求7-8任一項(xiàng)所述的試劑盒在法醫(yī)dna樣本定量和樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。