本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體是一種含有子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的陰道修復(fù)凝膠，及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、陰道是女性生殖系統(tǒng)中最重要的結(jié)構(gòu)之一，它不僅承載著性生活功能，還參與分娩、排尿等多種生理功能。然而，在許多生理或病理情況下，女性的陰道會(huì)發(fā)生損傷。常見(jiàn)的陰道損傷包括產(chǎn)后陰道撕裂、陰道萎縮、慢性陰道炎、手術(shù)后的陰道修復(fù)等。這些損傷不僅會(huì)影響女性的生理功能，還可能帶來(lái)心理上的困擾，影響生活質(zhì)量。因此，如何快速、安全、有效地促進(jìn)陰道損傷的修復(fù)，成為了婦科領(lǐng)域的一項(xiàng)重要研究課題。目前，治療陰道損傷的方法主要包括局部用藥、手術(shù)治療和激素治療等。局部用藥多為抗生素、止痛藥、抗炎藥等，主要用于緩解炎癥和止痛，但無(wú)法有效促進(jìn)損傷組織的再生。手術(shù)治療通常用于處理較嚴(yán)重的陰道撕裂或畸形，但手術(shù)本身存在一定的風(fēng)險(xiǎn)和創(chuàng)傷，且恢復(fù)周期較長(zhǎng)。激素治療主要用于治療因雌激素水平下降所導(dǎo)致的陰道萎縮，但激素的長(zhǎng)期使用可能會(huì)引起其他副作用，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等風(fēng)險(xiǎn)。因此，亟需一種既能有效促進(jìn)陰道組織修復(fù)，又能避免傳統(tǒng)治療方法副作用的治療方式。

2、隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展，干細(xì)胞療法逐漸成為組織修復(fù)和再生的前沿領(lǐng)域。干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，能夠在損傷或缺損的組織中發(fā)揮重要的修復(fù)作用。干細(xì)胞的應(yīng)用范圍包括心血管、神經(jīng)、骨骼等多個(gè)領(lǐng)域。近年來(lái)，干細(xì)胞在生殖系統(tǒng)修復(fù)中的研究也逐步開(kāi)展，尤其是子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial?stemcells,escs)，因其來(lái)源方便、免疫原性低、分化潛能強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，成為了一種非常有前景的治療材料。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞是來(lái)源于女性子宮內(nèi)膜組織的一類成體干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖與分化能力。研究表明，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞能夠在體外分化為多種類型的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。這些特性使得子宮內(nèi)膜干細(xì)胞具有在陰道組織修復(fù)中的潛力。

3、目前市場(chǎng)上用于陰道修復(fù)的凝膠產(chǎn)品大多包含一些常見(jiàn)的生物高分子材料，如透明質(zhì)酸鈉(ha)、明膠、海藻酸鈉等。這些凝膠基質(zhì)能夠提供一定的濕潤(rùn)環(huán)境，并促進(jìn)局部愈合。然而，這些凝膠大多數(shù)僅用于緩解陰道干燥、止痛、消炎等，并未能在修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮主動(dòng)作用。因此，如何增強(qiáng)陰道修復(fù)凝膠的生物修復(fù)功能，成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

4、目前，已有一些研究嘗試將干細(xì)胞應(yīng)用于凝膠體系中，借助干細(xì)胞的再生能力來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)。例如，有學(xué)者研究過(guò)利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)和脂肪干細(xì)胞(adsc)進(jìn)行局部注射或體外培養(yǎng)來(lái)促進(jìn)組織愈合。然而，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞作為一種新的干細(xì)胞來(lái)源，因其更接近于女性生殖系統(tǒng)的生理環(huán)境，成為了近年來(lái)的研究焦點(diǎn)。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，并具有較強(qiáng)的再生能力，因此，將其應(yīng)用于陰道修復(fù)凝膠中，有望帶來(lái)更為顯著的修復(fù)效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種含有子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的陰道修復(fù)凝膠及其制備方法。該凝膠具有良好的生物相容性，并能夠通過(guò)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的作用促進(jìn)陰道組織的自我修復(fù)。凝膠中的干細(xì)胞不僅有助于修復(fù)損傷的陰道組織，還能通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子促進(jìn)局部組織的再生。

2、因此，本發(fā)明一方面公開(kāi)了一種抗gsk-3β單克隆抗體，所述抗gsk-3β單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。

3、在一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述方法包括以下步驟：

4、(1)子宮內(nèi)膜組織的采集與運(yùn)輸；

5、(2)組織解離與細(xì)胞分離：使用無(wú)菌pbs洗滌采集的子宮內(nèi)膜組織，去除血液和雜質(zhì)；使用無(wú)菌剪刀和鑷子將子宮內(nèi)膜組織切割成1-2mm3的小塊；將切割后的組織塊放入含有2-5mg/ml胰蛋白酶的消化液中，輕輕搖動(dòng)容器，放入37℃水浴中，消化30-60分鐘；用含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基加入消化液中，終止消化反應(yīng)，并將容器離心以去除胰蛋白酶；對(duì)上述消化后的細(xì)胞利用微流控芯片技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高效篩選和富集；

6、(3)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)：以1×106細(xì)胞/ml的密度接種至無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，使用dmem/f12培養(yǎng)基補(bǔ)充10％胎牛血清、1％青鏈霉素、1％谷氨酰胺及5μg/ml抗gsk-3β單克隆抗體；將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-3天；每2-3天更換培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)學(xué)變化；通過(guò)顯微鏡檢查細(xì)胞的生長(zhǎng)與形態(tài)，確保沒(méi)有污染和細(xì)胞死亡；細(xì)胞生長(zhǎng)至70％-80％融合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行1:3至1:4的傳代。

7、在一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種含有子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的陰道修復(fù)凝膠，所述凝膠的配方如下所示：

8、(1)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞：每毫升凝膠中含有1×106至1×107個(gè)活細(xì)胞；

9、(2)凝膠基質(zhì)成分

10、1)透明質(zhì)酸鈉：凝膠中濃度為10-20mg/ml；

11、2)明膠：凝膠中濃度為30-50mg/ml；

12、3)海藻酸鈉：凝膠中濃度為5-20mg/ml；

13、(3)細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子

14、1)表皮生長(zhǎng)因子：凝膠中濃度為10-50ng/ml；

15、2)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β：凝膠中濃度為1-5ng/ml；

16、3)血小板衍生生長(zhǎng)因子：凝膠中濃度為10-50ng/ml；

17、4)基質(zhì)金屬蛋白酶：凝膠中濃度為1-10ng/ml；

18、(4)其他輔料

19、1)甘油：凝膠中體積比為3-5％；

20、2)磷酸鹽緩沖液：用于調(diào)節(jié)凝膠的ph值，維持凝膠的生理穩(wěn)定性，凝膠中濃度為適量，確保凝膠ph值保持在6.8-7.4之間。

21、優(yōu)選地，本發(fā)明所述凝膠的配方如下所示：

22、(1)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞：每毫升凝膠中含有1×106至1×107個(gè)活細(xì)胞；

23、(2)凝膠基質(zhì)成分

24、1)透明質(zhì)酸鈉：凝膠中濃度為15mg/ml；

25、2)明膠：凝膠中濃度為40mg/ml；

26、3)海藻酸鈉：凝膠中濃度為10mg/ml；

27、(3)細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子

28、1)表皮生長(zhǎng)因子：凝膠中濃度為30ng/ml；

29、2)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β：凝膠中濃度為3ng/ml；

30、3)血小板衍生生長(zhǎng)因子：凝膠中濃度為25ng/ml；

31、4)基質(zhì)金屬蛋白酶：凝膠中濃度為5ng/ml；

32、(4)其他輔料

33、1)甘油：凝膠中體積比為4％；

34、2)磷酸鹽緩沖液：適量進(jìn)行ph值的調(diào)節(jié)，確保凝膠ph值保持在7.0-7.2之間。

35、在一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了所述的抗gsk-3β單克隆抗體在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明通過(guò)將子宮內(nèi)膜干細(xì)胞與天然高分子基質(zhì)材料相結(jié)合，制備出一種新型的陰道修復(fù)凝膠。與傳統(tǒng)的陰道修復(fù)凝膠不同，本發(fā)明的凝膠不僅能夠?yàn)閾p傷組織提供物理支持，還能夠通過(guò)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的作用促進(jìn)組織再生。這種凝膠可通過(guò)局部應(yīng)用實(shí)現(xiàn)對(duì)陰道損傷的修復(fù)，具有以下顯著優(yōu)勢(shì)：

37、(1)生物修復(fù)能力強(qiáng)：子宮內(nèi)膜干細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化潛能和自我修復(fù)能力，能夠在受損組織中發(fā)揮重要的再生作用。

38、(2)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的輔助作用：凝膠中添加的細(xì)胞因子(如egf、tgf-β、pdgf等)能夠促進(jìn)局部細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成，從而加速修復(fù)過(guò)程。

39、(3)生物相容性好：凝膠的基質(zhì)成分包括透明質(zhì)酸鈉、明膠、海藻酸鈉等天然高分子材料，具有良好的生物相容性和降解性，對(duì)組織無(wú)刺激性。

40、(4)局部治療：該凝膠通過(guò)陰道局部應(yīng)用即可發(fā)揮治療作用，避免了傳統(tǒng)治療方法的副作用和創(chuàng)傷。

41、因此，本發(fā)明提供的陰道修復(fù)凝膠在治療產(chǎn)后陰道損傷、老年性陰道萎縮、手術(shù)后陰道修復(fù)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，并可為女性提供一種更加安全、有效的修復(fù)方案。