本發(fā)明涉及核酸測序，具體而言，涉及一種基于三代測序平臺的hla基因擴增引物及其應用。

背景技術：

1、人類白細胞抗原（human?leukocyte?antigen，簡稱hla）是人類主要組織相容性復合體的表達產(chǎn)物，位于第6號染色體短臂上，由一系列緊密連鎖的基因座組成。hla系統(tǒng)在免疫系統(tǒng)中扮演著至關重要的角色，主要功能是編碼細胞表面的抗原肽遞呈分子，這些分子能夠將抗原肽遞呈給t細胞表面的t細胞受體（tcr），從而激活免疫應答。

2、hla按其分布和功能分為ⅰ類抗原和ⅱ類抗原。hla-i類分子為內源性抗原的遞呈分子；hla-ⅱ類分子為外源性抗原的遞呈分子。hlaⅰ類抗原的特異性取決于α重鏈，由hla-a、b、c位點編碼；其β輕鏈是β2-微球蛋白，編碼基因在第15染色體。hlaⅱ類抗原受控于hla-d區(qū)(包含核苷酸序列為5個亞區(qū))，由其中的a基因和b基因分別為α重鏈和β輕鏈編碼，抗原多態(tài)性取決于β輕鏈。以上各基因均系多態(tài)性位點(復等位)，且共顯性。

3、如果把mhc作為一個整體來看待，其多態(tài)性則更為突出。保守地估計，至少存在1300個不同的單體型，相應地約有17×10的七次方個基因型。hla系統(tǒng)是多態(tài)性最為豐富的遺傳系統(tǒng)之一，意味著在不同個體之間存在許多不同的hla基因變體（等位基因）。在醫(yī)學上，匹配上正確而又高精度的hla分型對器官移植供受體匹配，自身免疫疾病研究，法醫(yī)親自或身份鑒定等方面有重要應用。

4、目前hla檢測技術有血清學分型，但其操作復雜，容易出現(xiàn)交叉反應，精度和分辨率低，目前已經(jīng)逐步被pcr和測序技術代替?；趐cr的hla檢測技術主要有序列特異性寡核苷酸序列探針雜交（sequence-specific?oligonucleotides?probes；sso），特異性引物pcr（sequence-specific?primers；ssp），基于直接測序法（sequence-based?typing,?sbt）和基于下一代測序（next?generation?sequencing,?ngs）。sso技術根據(jù)探針和pcr擴增產(chǎn)物的雜交信號來判斷hla基因型，操作較為繁瑣，難以檢出新的等位基因，只能針對已知的分型序列進行區(qū)分，解讀包含核苷酸序列為一定的主觀性。ssp也無法檢測新的等位基因的問題，并且無法分辨?zhèn)位颉bt技術基于一代測序，可以檢出新的等位基因，但是無法區(qū)分兩條等位基因，會產(chǎn)模糊的結果。ngs基于二代測序技術，可以檢出新的等位基因，但是測序長度一般較短，無法把hla基因全部測通，還是局限在2、3、4號外顯子（現(xiàn)有技術中研究較多的位點），仍然無法得到內含子以及utr區(qū)域的序列信息，分型精度一般達到4分位。由于hla包含核苷酸序列為極高的多態(tài)性，以上技術還有無法克服的問題，往往得到模棱兩可的結果。

5、現(xiàn)有技術采用三代測序技術對ⅰ類hla基因進行了單體擴增（非多重擴增），此種方法僅對ⅰ類hla基因（三個hla基因）進行擴增，hla基因的覆蓋量少并且該方法采用單一基因位點擴增，存在操作繁瑣和成本高的問題。專利申請cn?113817725?a利用三代測序長讀長的優(yōu)勢以及在引物的設計上增加擴增區(qū)域，能有效的提供完整的hla（包括外顯子和內含子）信息，提高分型的靈敏度和準確度。但是該方法存在非特異性擴增多、靶標擴增均一性差以及單樣本單獨建庫，建庫成本高等缺陷。因此，開發(fā)一種特異性擴增強，靶標擴增均一性高且建庫成本低并且能夠有效獲得完整hla信息的hla分型的檢測方法尤為重要。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的主要目的在于提供一種基于三代測序平臺的hla基因擴增引物及其應用，以解決現(xiàn)有技術中的hla基因測序時hla基因擴增特異性差的問題。

2、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種hla基因的擴增引物，上述擴增引物包含如下九組引物中的任意一組或任意多組的組合物：其中，

3、第一組引物包含具有seq?id?no：1所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?id?no：2所示核苷酸序列的下游引物；

4、第二組引物包含具有seq?id?no：3所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?id?no：4所示核苷酸序列的下游引物；

5、第三組引物包含具有seq?id?no：5所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?id?no：6所示核苷酸序列的下游引物；

6、第四組引物包含具有seq?id?no：7所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?id?no：8所示核苷酸序列的下游引物；

7、第五組引物包含具有seq?id?no：9所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?id?no：10所示核苷酸序列的下游引物；

8、第六組引物包含具有seq?id?no：11所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?idno：12所示核苷酸序列的下游引物；

9、第七組引物包含具有seq?id?no：13所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?idno：14所示核苷酸序列的下游引物；

10、第八組引物包含具有seq?id?no：15所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?idno：16所示核苷酸序列的下游引物；

11、第九組引物包含具有seq?id?no：17所示核苷酸序列的上游引物和具有seq?idno：18和/或具有seq?id?no：19所示核苷酸序列的下游引物。

12、進一步地，上述九組引物中，各組引物內上游引物和下游引物間的摩爾比為：（0.9~1.1）：（0.9~1.1）。

13、進一步地，上述擴增引物為上述九組引物中的任意多組的組合物；上述組合物中，各組引物間的摩爾比為：上述第一組引物：上述第二組引物：上述第三組引物：上述第四組引物：上述第五組引物：上述第六組引物：上述第七組引物：上述第八組引物：上述第九組引物為（2.9~3.1）：（1.9~2.1）：（1.9~2.1）：（8.9~9.1）：（16.9~17.1）：（10.9~11.1）：（25.9~26.1）：（3.9~4.1）：（11.9~12.1）。

14、進一步地，上述擴增引物的5’端含有標簽序列。

15、進一步地，上述標簽序列為6~10bp寡核苷酸序列。

16、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了一種試劑盒，上述試劑盒包括上述的擴增引物。

17、進一步地，上述試劑盒還包括如下任意一種或多種試劑：pcr擴增試劑、基因純化試劑、測序文庫構建試劑或測序試劑；其中，上述pcr擴增試劑包括：水、dntp、dna聚合酶和dna聚合酶緩沖液。

18、進一步地，上述dna聚合酶選自如下任意一種：kod?fx?neo、kod?-multi?&?epi-、kod?fx、kod?onetm?pcr?master?mix或kod?-plus-?neo。

19、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供了一種hla基因pcr擴增的方法，該方法包括：采用上述的擴增引物進行pcr擴增，得到上述hla基因擴增產(chǎn)物。

20、進一步地，上述pcr擴增的反應程序選自如下任意一種：

21、1）94℃?2min，(98℃?10s，74℃?12min)*4個循環(huán)，(98℃?10s，72℃?12min)*4個循環(huán)，(98℃?10s，70℃?12min)*4個循環(huán)，(98℃?10s，68℃?12min)*18個循環(huán)，68℃?7min，4℃保存；

22、2）94℃?2min，(98℃?10s，72℃?12min)*2個循環(huán)，(98℃?10s，70℃?12min)*2個循環(huán)，(98℃?10s，68℃?12min)*21個循環(huán)，68℃?7min，4℃?保存；

23、3）94℃?2min，(98℃?10s，74℃12min)*1個循環(huán)，(98℃?10s，73℃?12min)*1個循環(huán)，(98℃?10s，72℃?12min)*1個循環(huán)，(98℃?10s，71℃?12min)*1個循環(huán)，(98℃?10s，70℃12min)*1個循環(huán)，(98℃?10s，69℃?12min)*1個循環(huán)，(98℃?10s，68℃?12min)*21個循環(huán)，68℃?7min，4℃?保存。

24、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供了一種hla基因測序文庫的構建方法，該構建方法包括：將hla基因的擴增產(chǎn)物與測序接頭連接，得到上述hla基因測序文庫；

25、上述擴增產(chǎn)物選自采用上述的hla基因擴增引物擴增上述hla基因得到的擴增產(chǎn)物或采用上述的hla基因pcr擴增的方法擴增得到的擴增產(chǎn)物。

26、進一步地，將上述擴增產(chǎn)物與上述測序接頭連接之前，上述構建方法還包括：對上述擴增產(chǎn)物進行純化。

27、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供了一種hla基因測序方法，該hla基因測序方法包括：對測序文庫進行測序；上述測序文庫為采用上述的hla基因測序文庫的構建方法構建的測序文庫。

28、進一步地，上述測序采用三代測序技術。

29、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，提供了一種hla基因分型檢測方法，該hla基因分型檢測方法包括：采用上述的hla基因測序方法對hla基因型進行檢測并分型。

30、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，提供了一種上述的擴增引物或上述的試劑盒在制備hla基因分型檢測試劑中的應用。

31、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的第七個方面，提供了一種上述的擴增引物或上述的試劑盒或上述的hla基因pcr擴增的方法或上述的hla基因測序文庫的構建方法或上述的hla基因測序方法或上述的hla基因分型檢測方法在hla基因分型中的應用。

32、進一步地，上述hla基因分型依次包括如下步驟：hla基因擴增、hla基因測序文庫。

33、應用本發(fā)明的技術方案，采用針對11個基因位點（包括：hla-a、hla-b、hla-c、hla-dpa1、hla-dpb1、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-drb1、hla-drb3、hla-drb4和hla-drb5）設計的擴增引物或其組合物，具體包含seq?id?nos：1-19所示的核苷酸序列。利用上述擴增引物或其組合物對hla基因進行特異性擴增富集，并對擴增后的片段進行混合建庫和測序，能夠有效獲取hla基因的全部信息（包括外顯子和內含子），實現(xiàn)了hla基因的近全長擴增。

34、本發(fā)明設計的擴增引物退火溫度相近，提高了hla基因標靶序列的富集特異性，降低無效數(shù)據(jù)占比。此外，采用上述擴增引物在本發(fā)明的擴增程序下，能夠實現(xiàn)一管體系同時擴增多個基因且提高了靶標間的均一性，進而提高了數(shù)據(jù)利用率，降低后續(xù)所得測序數(shù)據(jù)的冗余。經(jīng)過后續(xù)多個樣本混合文庫構建（建庫）和基因測序后，所得各樣本間的數(shù)據(jù)均一性好。提高了hla基因測序數(shù)據(jù)分型的分辨率，實現(xiàn)hla分型的6分位分辨率。