本技術(shù)涉及微生物發(fā)酵，尤其是涉及一種n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)及其發(fā)酵方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、觀藍(lán)（indigoidine）是由微生物合成的一種具有抗氧化和抗菌活性的天然藍(lán)色色素，最早從植物病原菌歐文氏桿菌（erwinia?sp.）中發(fā)現(xiàn)，分子式為c10h8n4o4，其性質(zhì)與化學(xué)合成的藍(lán)色素靛藍(lán)類(lèi)似，可作為化學(xué)合成的藍(lán)色染料和色素的替代品應(yīng)用于紡織、食品等行業(yè)。觀藍(lán)色素是由非核糖體肽合成酶觀藍(lán)合成酶經(jīng)4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活化后，將微生物體內(nèi)的兩分子谷氨酰胺催化聚合生成一分子觀藍(lán)。

2、前期，本技術(shù)人公開(kāi)申請(qǐng)?zhí)枮閏n2024107899337的專(zhuān)利，其公開(kāi)了一種以谷氨酸為底物生物合成n-乙酰觀藍(lán)代謝工程菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用，該申請(qǐng)中工程菌hg-n-idg06的觀藍(lán)合成酶編碼基因、4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因、谷氨酰胺合成酶編碼基因和n-乙酰谷氨酸合成酶編碼基因利用谷氨酸合成n-乙酰觀藍(lán)。但n-乙酰觀藍(lán)在水中幾乎不溶的特性影響其染色效果，需添加助劑增加上染率，因此，還有改進(jìn)的空間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)及其發(fā)酵方法和應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采取的技術(shù)方案為：

3、本技術(shù)提供了一種n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)，所述n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的化學(xué)名稱(chēng)為n-(5'-羥氨基-2,6,2',6'-四氧-1,6,1',6'-四氫-2h,2'h-[3,3']聯(lián)吡啶亞甲基)-乙酰胺，分子式為c12h10o6n4；

4、所述n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式（i）所示；

5、

6、式（i）。

7、本技術(shù)提供了一種新的天然藍(lán)色素（n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)），通過(guò)質(zhì)譜、核磁等推斷出它的分子結(jié)構(gòu)如式（i）所示，最大吸收波長(zhǎng)為611nm。

8、相比于n-乙酰觀藍(lán)，n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的吸收為uv611顏色更深，同時(shí)與纖維上氨基形成氫鍵可增強(qiáng)染料對(duì)纖維的染著性提高耐水洗色牢度，因此，本技術(shù)的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)可以提高染色效果和耐水洗牢度。

9、本技術(shù)還提供了一種發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法，包括以下步驟：

10、s1、在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種活化后的重組菌株種子發(fā)酵液進(jìn)行第一階段發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧do為20~25%，發(fā)酵獲得第一階段發(fā)酵液；

11、s2、調(diào)節(jié)步驟s1獲得的第一階段發(fā)酵液的ph，然后添加合成酶誘導(dǎo)劑和羥基化酶輔因子（fe2+）進(jìn)行第二階段發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧do為40~45%，發(fā)酵獲得含有n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)發(fā)酵產(chǎn)物。

12、本技術(shù)通過(guò)調(diào)整發(fā)酵方法，利用合成酶誘導(dǎo)劑、羥基化酶輔因子和發(fā)酵條件（增加溶氧）可誘導(dǎo)羥基-l-谷氨酰胺的生成，可使得重組菌株由生產(chǎn)n-乙酰觀藍(lán)轉(zhuǎn)而生成n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)，最終生產(chǎn)的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)占比最高可達(dá)90%，通過(guò)質(zhì)譜核磁推斷出它的分子結(jié)構(gòu)。

13、本技術(shù)的方法包括菌體增殖的第一階段發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)羥基-l-谷氨酰胺積累的第二階段發(fā)酵培養(yǎng)，第一階段發(fā)酵主要是促進(jìn)菌株細(xì)胞快速增殖，第二階段發(fā)酵主要是誘導(dǎo)羥基-l-谷氨酰胺和l-谷氨酰胺中間體的生成，抑制n-乙酰觀藍(lán)的生成促進(jìn)n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的生成。

14、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量濃度的組分：

15、酵母粉5~10?g/l，10%液體葡萄糖20~40g/l，硫酸銨10~20g/l，磷酸二氫鉀0.2~1g/l，七水硫酸鎂0.2~0.4?g/l，一水硫酸錳0.01~0.02g/l，生物素2~4μg/l，vb10.2~0.4mg/l，谷氨酸鈉1~2g/l，溶劑為水，ph7.0。

16、本技術(shù)采用以上配方的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，可以更好地發(fā)酵重組菌株，使得重組菌株可以生產(chǎn)n-乙酰觀藍(lán)轉(zhuǎn)而生成n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)。

17、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述重組菌株為表達(dá)載體i和表達(dá)載體ii導(dǎo)入菌株構(gòu)建而得；

18、所述表達(dá)載體i為谷氨酰胺合成酶編碼基因ecglna和n-乙酰谷氨酸合成酶編碼基因ecarga插入質(zhì)粒的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，得到表達(dá)載體i；

19、所述表達(dá)載體ii為觀藍(lán)合成酶編碼基因bpsa和4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd插入質(zhì)粒的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，得到表達(dá)載體ii。

20、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述菌株包括大腸桿菌。

21、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述質(zhì)粒包括prsfduet-1質(zhì)粒。

22、優(yōu)選地，所述重組菌株為表達(dá)載體prsfduet-ecglna-ecarga和pcdfduet-bpsa-entd導(dǎo)入大腸桿菌構(gòu)建而得，為hg-n-idg06，來(lái)源于專(zhuān)利號(hào)為cn2024107899337（專(zhuān)利名稱(chēng)為一種以谷氨酸為底物生物合成n-乙酰觀藍(lán)代謝工程菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用）；

23、所述表達(dá)載體prsfduet-ecglna-ecarga為谷氨酰胺合成酶編碼基因ecglna和n-乙酰谷氨酸合成酶編碼基因ecarga插入prsfduet-1質(zhì)粒兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，得到表達(dá)載體prsfduet-ecglna-ecarga；

24、所述表達(dá)載體pcdfduet-bpsa-entd為觀藍(lán)合成酶編碼基因bpsa和4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd插入pcdfduet-1質(zhì)粒兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，得到表達(dá)載體pcdfduet-bpsa-entd。

25、其中，hg-n-idg06的底盤(pán)菌株中含p450單加氧化酶，第二個(gè)發(fā)酵階段通過(guò)加入誘導(dǎo)劑、羥基化酶輔因子和增加溶氧共同誘導(dǎo)底盤(pán)菌株中p450單加氧化酶表達(dá)將l-谷氨酰胺氧化為羥基-l-谷氨酰胺，以此抑制工程菌hg-n-idg06利用一分子谷氨酰胺和一分子n-乙酰谷氨酰胺合成n-乙酰觀藍(lán)轉(zhuǎn)而利用一分子n-乙酰谷氨酰胺和一分子羥基-l-谷氨酰胺生成n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)。

26、本技術(shù)通過(guò)調(diào)整發(fā)酵方法抑制重組菌株hg-n-idg06生成n-乙酰觀藍(lán)轉(zhuǎn)而促進(jìn)n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的生成。相比于n-乙酰觀藍(lán)，n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的吸收為uv611顏色更深，同時(shí)與纖維上氨基形成氫鍵可增強(qiáng)染料對(duì)纖維的染著性提高耐水洗色牢度。

27、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟s1中，第一階段發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：溫度為35~40℃；發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為0~24h；通氣量為0.8~1.0vvm。

28、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟s2中，第二階段發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：溫度為20~30℃；發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為24~72h；通氣量為1.8~2.0vvm。

29、本技術(shù)采用第一階段發(fā)酵培養(yǎng)、第二階段發(fā)酵培養(yǎng)的條件，可以通過(guò)控制發(fā)酵過(guò)程中的溫度、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間、通氣量和轉(zhuǎn)速在上述范圍時(shí)可以誘導(dǎo)n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的生成。通氣比用于維持溶氧，溶氧高于40％出現(xiàn)的富氧狀態(tài)在輔因子的作用下生成羥基-l-谷氨酰胺。

30、優(yōu)選地，所述活化的具體步驟，包括：

31、將含有重組菌株的甘油菌液接入裝有液體培養(yǎng)基的試管中，振蕩培養(yǎng)，然后按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5%~2%的接種體積轉(zhuǎn)接至裝有基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中添加終濃度為50?μg/ml的卡那霉素培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為32~37℃，轉(zhuǎn)速為170~220rpm，時(shí)間為8~10?h，至菌液的od600＞3，得到活化后的菌液。

32、所述液體培養(yǎng)基包括lb液體培養(yǎng)基。

33、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，

34、所述步驟s2中，第一階段發(fā)酵液的ph為6.0~6.5。

35、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟s2中，第一階段發(fā)酵液進(jìn)行第二階段發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液的葡萄糖濃度低于2g/l時(shí)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；

36、所述補(bǔ)料培養(yǎng)基包括以下濃度的組分：

37、葡萄糖400~600?g/l，七水硫酸鎂2~4g/l，氯化銨40~80?g/l，溶劑為水。

38、當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度低于2g/l時(shí)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，最后發(fā)酵至n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的占比最大結(jié)束發(fā)酵，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。

39、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟s2中，所述合成酶誘導(dǎo)劑包括iptg誘導(dǎo)劑；所述羥基化酶輔因子包括七水硫酸亞鐵。

40、作為本技術(shù)所述發(fā)酵所述的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述iptg誘導(dǎo)劑的質(zhì)量濃度為0.5~1.5?mm；

41、所述七水硫酸亞鐵的質(zhì)量濃度為1.0~3.5mm。

42、本技術(shù)采用七水硫酸亞鐵誘導(dǎo)激活羥基化反應(yīng)酶活性，進(jìn)而促進(jìn)羥基化誘導(dǎo)，七水硫酸亞鐵溶解于補(bǔ)料培養(yǎng)基，隨補(bǔ)料培養(yǎng)基一道添加；添加七水硫酸亞鐵后的補(bǔ)料培養(yǎng)基，還包括七水硫酸亞鐵0.25~0.97g/l。

43、本技術(shù)還提供了一種發(fā)酵產(chǎn)物，所述發(fā)酵產(chǎn)物包括副產(chǎn)物1和副產(chǎn)物2；

44、所述副產(chǎn)物1的分子式為c12h10o6n4，副產(chǎn)物1的化學(xué)名稱(chēng)為n-(5'-氨基-1'-羥基-2,6,2',6'-四氧-1,6,1',6'-四氫-2h,2'h-[3,3']聯(lián)吡啶亞甲基)-乙酰胺；

45、所述副產(chǎn)物2分子式為c12h10o6n4，副產(chǎn)物2化學(xué)名稱(chēng)為n-(5'-氨基-1-羥基-2,6,2',6'-四氧-1,6,1',6'-四氫-2h,2'h-[3,3']聯(lián)吡啶亞甲基)-乙酰胺；

46、所述副產(chǎn)物1和副產(chǎn)物2的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式（ii）所示；

47、

48、式ⅱ。

49、本技術(shù)還提供了上述n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)在織物染色中的應(yīng)用。

50、本技術(shù)通過(guò)調(diào)整發(fā)酵方法利用iptg誘導(dǎo)劑促使工程菌生成中間代謝產(chǎn)物形成n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)，最終生產(chǎn)的n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)占比最高可達(dá)90%，通過(guò)質(zhì)譜推斷出它的分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)本發(fā)酵方法獲得了兩個(gè)類(lèi)似結(jié)構(gòu)的新產(chǎn)物。相比于n-乙酰觀藍(lán)，n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的吸收為uv611顏色更深，同時(shí)與纖維上氨基形成氫鍵可增強(qiáng)染料對(duì)纖維的染著性提高耐水洗色牢度。

51、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)具有以下有益效果：

52、本技術(shù)提供了一種n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)及其發(fā)酵方法和應(yīng)用，本技術(shù)的發(fā)酵方法包括菌體增殖的第一階段發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)羥基-l-谷氨酰胺積累的第二階段發(fā)酵培養(yǎng)，第一階段發(fā)酵主要是促進(jìn)菌株細(xì)胞快速增殖，第二階段發(fā)酵主要是誘導(dǎo)羥基-l-谷氨酰胺和l-谷氨酰胺中間體的生成，抑制n-乙酰觀藍(lán)的生成促進(jìn)n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的生成。相比利用專(zhuān)利cn2024107899337的基因工程菌hg-n-idg06生成n-乙酰觀藍(lán)，本技術(shù)通過(guò)改變發(fā)酵方法條件誘導(dǎo)中間代謝產(chǎn)物羥基-l-谷氨酰胺的生成結(jié)合n-乙酰l-谷氨酰胺形成n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)。相比于n-乙酰觀藍(lán)，n-羥氨基-n’-乙酰觀藍(lán)的吸收為uv611顏色更深，同時(shí)與纖維上氨基形成氫鍵可增強(qiáng)染料對(duì)纖維的染著性提高耐水洗色牢度。