本發(fā)明涉及基因工程，尤其涉及β-法尼烯合酶突變體及改造菌株與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、法尼烯（farnesene,?c15h24）作為一種高度不飽和化合物，具有較強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)性，是一種無環(huán)倍半萜烯。根據(jù)法尼烯構(gòu)型中的雙鍵位置不同，分為α-法尼烯、β-法尼烯以及x-法尼烯，其中，α-法尼烯具有花瓣和蘋果的氣味；β-法尼烯具有膠水和塑料的氣味；x-法尼烯偶爾會出現(xiàn)在薰衣草精油中。由于法尼烯本身具有的特性，在能源化工、香精香料、醫(yī)藥生產(chǎn)、化妝品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。在能源化工方面，法尼烯衍生物的能量密度遠(yuǎn)高于3號航空煤油，可作為燃油助劑顯著提高其性能，有效延長航程、增加載彈量，具有重要的軍事意義和戰(zhàn)略意義。在醫(yī)藥生產(chǎn)中，法尼烯可以作為生產(chǎn)維生素e側(cè)鏈（異植物醇）的中間體，可實(shí)現(xiàn)維生素e生產(chǎn)工藝的創(chuàng)新性變革（側(cè)鏈異植物醇合成由11步縮短至3步）。

2、相對于另外兩種法尼烯，β-法尼烯是主要的蚜蟲報警外激素，可以被開發(fā)為一種環(huán)境友好型的害蟲防治劑。通過人工合成β-法尼烯或者利用基因工程手段提高植物自身釋放β-法尼烯的能力，可以有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。例如，在一些果園中，釋放β-法尼烯誘芯可以吸引害蟲天敵，控制害蟲的種群數(shù)量。法尼烯的化學(xué)合成方法受原料來源、產(chǎn)品得率、污染排放等因素制約已被生物合成全面取代。

3、目前β-法尼烯可以通過植物提取法或化學(xué)合成法，但植物提取法限制條件較為嚴(yán)格，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化；化學(xué)合成法缺乏立體構(gòu)型控制手段，工業(yè)級原料不夠純凈；但是，通過植物提取法生產(chǎn)法尼烯，通常不可持續(xù)且受到嚴(yán)格的地理和氣候條件的限制，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。且化學(xué)合成法缺乏立體控制所獲得的產(chǎn)物為工業(yè)級原料，因此利用合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)進(jìn)行微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-法尼烯是非常有意義的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供β-法尼烯合酶突變體及改造菌株與應(yīng)用。

2、本發(fā)明對基因合成得到的青蒿來源的法尼烯合成酶（aafs）進(jìn)行突變，通過基因整合得到含有突變體的基因工程菌株；并且得到的基因工程菌株能夠保證發(fā)酵時間為96h的基礎(chǔ)上，有效提高β-法尼烯的含量。

3、本發(fā)明提供的青蒿來源法尼烯合成酶的突變體，所述青蒿來源法尼烯合成酶的氨基酸序列如seq?id?no:1所示，所述突變體包括如下突變位點(diǎn)中的至少一種：

4、t434i、d248n、k197l、k197t、k197y、k197a、k197m、k197h、k197f、k197g、k197r、k197e、k197q、k197s、k197w、k197i、k197p、k197v、k197c、k197d、k197n、t526a、t526e、t526f、t526l、t526h、t526g、t526p、t526s、t526y、t526k、t526v、t526m、t526n、t526d、t526c、t526i、t526w、t526q、t526r、s11f、p28q、h33n、k58e、k70r、i100v、h116y、v150i、f180y、d185g、r227k、d248n、s260n、r407k、i423v、t434i、a442g、s455t、s475t、e544d或k561i。

5、一些實(shí)施例中，所述突變體中突變位點(diǎn)為k197a、t526i、h116y、r227k、d248n或t434i中至少一種。

6、作為可行性案例，所述突變體中包括突變位點(diǎn)：k197a和t526n，或包括k197a和t526i，或包括k197m和t526n，或包括k197m和t526i，或包括d248n和r227k，或包括d248n和h116y，或包括d248n和t434i，或包括r227k和h116y，或包括r227k和t434i，或包括h116y和t434i。

7、一些具體實(shí)施例中，所述突變位點(diǎn)包括k197a、t526i、t434i或r227k中至少一種。

8、本發(fā)明通過對突變體進(jìn)行篩選，得到的gl0116::aafst434i突變菌株和gl0116::aafs?r227k-t434i突變菌株，其β-法尼烯的含量分別為2.32?g/l和2.23?g/l，較未突變菌株分別提高了58.3%和52.2%。由于aafs為β-法尼烯的特異性合成酶，故通過氣相方法檢測到的僅為β-法尼烯，無α-法尼烯產(chǎn)生。作為優(yōu)選，所述突變體中突變位點(diǎn)包括r227k和t434i。

9、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了編碼所述的突變體的核酸。

10、本發(fā)明根據(jù)酵母菌的特性，對編碼核酸進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。在諸多優(yōu)化方案中，seq?id?no.2所示核酸序列編碼的aafs?r227k-t434i突變體具有最優(yōu)秀的表達(dá)效果和β-法尼烯產(chǎn)量。

11、作為優(yōu)選，所述核酸具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列；

12、或具有在如seq?id?no:2所示的核酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)取代、缺失、添加和/或替換1個或多個核苷酸的序列；

13、或具有與如seq?id?no:2所示的核酸序列同一性80％以上的序列。

14、所述同一性80%以上，包括80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上或99.9%以上。

15、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)框，其包括啟動子和如前所述的核酸。

16、一些實(shí)施例中，所述啟動子為真核生物啟動子或原核生物啟動子，本發(fā)明對此不做限定。例如，所述啟動子為tef1?promoter、gap?promoter、gal1?promoter、gal10promoter、adh1?promoter、pgk1?promoter、tef1?promoter、cyc1?promoter、his3promoter、ura3?promoter、leu2?promoter、met25?promoter。本發(fā)明中，所述表達(dá)框中還可以復(fù)制子、終止子和/或增強(qiáng)子。例如，所述復(fù)制子為?2μ?ori，pbr322?ori或f1?ori，所述增強(qiáng)子選自uasgal、uasg、hse（熱激元件）、cup1?-?uas、uasino、uasctr、uasste、uasph05、uastyr1或uasrnr。例如，所述終止子選自adh1?terminator、cyc1?terminator、cyc1terminator、pgk1?terminator、tdh3?terminator、cdc20t?terminator、hrr25tterminator、fob1t?terminator、hda1t?terminator、dep1t?terminator、pda1tterminator、sld2t?terminator。

17、本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒載體，其包括如前所述的核酸或如前所述的表達(dá)框。

18、本發(fā)明中，所述的質(zhì)粒載體為克隆載體或表達(dá)載體。本發(fā)明中，所述質(zhì)粒載體用于所述核酸或所述表達(dá)框的存儲、擴(kuò)增或者用于所述突變體的表達(dá)，本發(fā)明對此不做限定。一些實(shí)施例中，所述載體為質(zhì)粒載體，其包括但不限于py26、yep13、yep24、yep351、yep352、yep353、yep354、yep355、yep356、yep356r、yep357、yep357r、yep358、yep363、yep364、yep365、yep366、yep366r、yep367、yep367r、yep368。

19、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化體，其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有如前所述質(zhì)粒載體，或者其基因組中整合有如前所述的核酸或整合有如前所述的表達(dá)框。

20、本發(fā)明中，所述宿主用于如前所述核酸片段、表達(dá)框或質(zhì)粒載體的擴(kuò)增或存儲，也可以用于如前所述突變體的表達(dá)，或用于β-法尼烯的制備，本發(fā)明對此不做限定。例如，所述轉(zhuǎn)化子為真核生物宿主或原核生物宿主，所述真核生物宿主包括但不限于酵母菌、昆蟲細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞，所述原核生物宿主包括但不限于大腸桿菌。

21、作為可行性案例，用作擴(kuò)增或存儲的轉(zhuǎn)化子的宿主為大腸桿菌，用作β-法尼烯的制備的轉(zhuǎn)化子宿主為酵母菌。例如，所述宿主為hansenula?polymorpha（多形漢遜酵母）、pichia?pastoris（畢赤酵母）、debaryomyces?hansenii（漢森德巴利酵母）、kluyveromyceslactis（乳酸克魯維酵母）、yarrowia?lipolytica（解脂耶氏酵母）、saccharomycescerevisiae?var.?diastaticus（糖化酵母）、schizosaccharomyces?pombe（粟酒裂殖酵母）、rhodotorula?glutinis（紅冬孢酵母）。一些實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)化體的宿主為釀酒酵母。

22、本發(fā)明對宿主進(jìn)行篩選和優(yōu)化，結(jié)果表明不同的底盤菌對β-法尼烯的產(chǎn)量存在明顯的影響。作為優(yōu)選，本發(fā)明中所述轉(zhuǎn)化子的宿主的基因型為cen.pk113-7d::acs1-6::erg10::erg13::thmg1::hmg2::erg12::erg8::erg19::idi1::erg20；或者其基因型為cen.pk113-7d::acs1-6::erg10::erg13::thmg1::hmg2::erg12::erg8::erg19::idi1::erg20::erg8-20::idi1::thmg::adh::acs::acl::zwf::gnd::pdr5::pdr10::osh3::vhbδdpp1δlpp1δgpd1::fs::?δbts1。

23、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種β-法尼烯的制備方法，其包括：培養(yǎng)如前所述的轉(zhuǎn)化體，獲得含有β-法尼烯的產(chǎn)物。

24、本發(fā)明提供的方法能夠縮短發(fā)酵時間，且培養(yǎng)基組成簡單，采用雙相發(fā)酵法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵時間由原來的120h縮短至96h，而β-法尼烯的產(chǎn)量可達(dá)31.67?g/l。

25、所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括水和(nh4)2so4?3?g/l、kh2po4?3.5?g/l、mgso4·7h2o?6.2g/l、葡萄糖?80?g/l、半乳糖?9.9?g/l、微量元素?10?ml/l、維生素120?μl/ml、cuso4·5h2o0.6?ml/l、10%（v/v）的正十二烷。

26、本發(fā)明對來源于青蒿的法尼烯合成酶（aafs）進(jìn)行突變得到的gl0116::aafst434i突變菌株和gl0116::aafs?r227k-t434i突變菌株，進(jìn)一步對底盤菌進(jìn)行篩選和優(yōu)化后，β-法尼烯的產(chǎn)量達(dá)到了31.67?g/l。