本發(fā)明涉及疫苗，尤其涉及一種自發(fā)形成包膜病毒樣顆粒的rsv?f突變體及其mrna疫苗，載體疫苗和重組蛋白疫苗的構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、呼吸道合胞病毒（respiratory?syncytial?virus,?rsv）是導(dǎo)致嬰幼兒、老年人和免疫功能低下個(gè)體急性呼吸道感染的最常見(jiàn)病原體之一。2019年，全球近3200萬(wàn)名5歲以下兒童感染?rsv并發(fā)展為下呼吸道感染，其中10%需要住院治療，且容易繼發(fā)阻塞性氣道疾病和哮喘。rsv同樣也給免疫缺陷人群和老年人群帶來(lái)了極大的疾病負(fù)擔(dān)。此外，rsv感染不能引發(fā)持久的抗體反應(yīng)，導(dǎo)致再次感染，給全球帶來(lái)了巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。rsv屬于副黏病毒科(paramyxoviridae)?、肺炎病毒亞科(pneumovirinae)以及肺病毒屬(pneumovirus)，非節(jié)段單股負(fù)鏈rna囊膜病毒。病毒粒子外層為脂質(zhì)囊膜，內(nèi)部是病毒核衣殼。病毒粒子有兩種不同形態(tài)，直徑為100-350?nm的球形狀，或直徑為60-200nm的纖絲狀。病毒顆粒由包膜、核衣殼和核心組成。包膜上鑲嵌著g、f和sh三種跨膜蛋白；核衣殼由殼粒組成；病毒核心是由病毒基因組rna和n、p、l等非結(jié)構(gòu)蛋白組成的復(fù)合體。f蛋白與g蛋白在rsv感染中介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的接觸與融合也是目前疫苗設(shè)計(jì)的主要靶點(diǎn)，f蛋白在不同亞型之間高度保守，而g蛋白高度可變。根據(jù)g蛋白第二高變區(qū)序列的差異可將rsv分為a、b兩種亞型。現(xiàn)有研究表明f蛋白在體內(nèi)至少存在兩種狀態(tài)：亞穩(wěn)態(tài)的融合前f蛋白（pref）以及穩(wěn)定的融合后f蛋白(postf)。
2、疫苗是預(yù)防rsv感染的有效措施之一。mrna在編碼蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸（dna）翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。mrna疫苗的原理是利用宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制，將mrna在胞內(nèi)譯成相應(yīng)的抗原，從而模擬病毒感染過(guò)程，誘發(fā)有效的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。其安全性好，免疫原性強(qiáng)、生產(chǎn)速度快和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)迅速成為生物醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的熱點(diǎn)方向。隨著sars-cov2的暴發(fā)，mrna疫苗首次被批準(zhǔn)用于人體，其安全性及有效性已被廣泛證實(shí)?，F(xiàn)有研究表明基于rsv?f蛋白的mrna疫苗在體內(nèi)引起強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，此外，與傳統(tǒng)蛋白疫苗相比，mrna疫苗還誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的cd4+和cd8+t細(xì)胞反應(yīng)，提示mrna疫苗在激活細(xì)胞免疫應(yīng)答方面具有潛在優(yōu)勢(shì)。
3、evlps（enveloped?virus-like?particles）疫苗可以將病毒抗原呈現(xiàn)在細(xì)胞表面或病毒組裝納米顆粒，將更有利于b細(xì)胞的激活從而誘導(dǎo)強(qiáng)的b細(xì)胞免疫應(yīng)答以期獲得長(zhǎng)期保護(hù)。evlp疫苗能夠精確地展示抗原。通過(guò)基因工程技術(shù)，可以將特定的抗原以最優(yōu)的構(gòu)象展示在vlp表面。evlp也可同時(shí)攜帶多種抗原或者抗原表位，實(shí)現(xiàn)多抗原協(xié)同刺激免疫系統(tǒng)。這些不同的抗原組合能夠模擬病毒的復(fù)雜抗原構(gòu)成，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生全面且持久的免疫反應(yīng)，增加疫苗對(duì)不同病毒株或者病毒變異體的保護(hù)效力。evlp?疫苗不僅能激活適應(yīng)性免疫，還能刺激先天性免疫。其病毒樣的結(jié)構(gòu)可以被先天免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體（prrs）識(shí)別，如toll?-?like受體（tlrs）。當(dāng)evlp被抗原呈遞細(xì)胞攝取后，會(huì)觸發(fā)一系列的先天免疫信號(hào)通路，釋放細(xì)胞因子和趨化因子，從而為適應(yīng)性免疫的啟動(dòng)創(chuàng)造有利的環(huán)境。這種先天性和適應(yīng)性免疫的雙重激活能夠更有效地清除病毒，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。
4、現(xiàn)有的基于pref的mrna疫苗在人體臨床研究表明其持續(xù)性保護(hù)不強(qiáng)，其可能原因是沒(méi)有很好地誘導(dǎo)出持久的記憶性t細(xì)胞和b細(xì)胞反應(yīng)。過(guò)度刺激了短期的抗體反應(yīng)，而沒(méi)有充分激活記憶細(xì)胞的生成。記憶b細(xì)胞和記憶t細(xì)胞對(duì)于長(zhǎng)期免疫至關(guān)重要。如果疫苗不能有效地誘導(dǎo)這些細(xì)胞的形成和維持，當(dāng)再次接觸rsv時(shí)，免疫系統(tǒng)可能無(wú)法快速有效地做出反應(yīng)。因此將mrna技術(shù)與evlp技術(shù)相結(jié)合，其在小鼠模型中可誘導(dǎo)相比mrna疫苗更強(qiáng)的中和抗體水平及記憶性b和記憶性t細(xì)胞免疫應(yīng)答。
5、escrt可招募相關(guān)通路蛋白至靶蛋白引起靶蛋白自組裝形成evlp，該途徑是由ege基序引起的。ege基序由三部分組成：epm，gs?linker,?eabr，epm用于實(shí)現(xiàn)靶蛋白在細(xì)胞表面滯留防止內(nèi)吞，gs?linker用于連接epm和eabr，eabr包含alix，tsg101結(jié)合域的一種或兩種。但不同的ege基序誘導(dǎo)的免疫效果存在差異，因此，對(duì)ege基序的選擇成為提高rsv?mrna疫苗免疫效果的重中之重。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中rsv?mrna疫苗不足，長(zhǎng)期保護(hù)性不足的問(wèn)題，提供一種新的、高效的、高安全的rsv?mrna疫苗，利用該技術(shù)產(chǎn)生的抗原也可廣泛應(yīng)用于腺病毒載體。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
3、本發(fā)明提供了一種自發(fā)形成包膜病毒樣顆粒的rsv?pref-evlp，所述pref-evlp中的目的基因主要由rsv?f蛋白和ege基序的核苷酸序列組成。
4、優(yōu)選的，所述rsv?f蛋白為原始f蛋白，所述原始f蛋白的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。
5、優(yōu)選的，所述rsv?f蛋白為經(jīng)過(guò)改造的f蛋白突變體。
6、優(yōu)選的，所述經(jīng)過(guò)改造的f蛋白突變體包括優(yōu)化的pref蛋白或截短的pref△ct蛋白。
7、優(yōu)選的，所述優(yōu)化的pref蛋白的優(yōu)化方法包括信號(hào)肽的替換、p27片段的刪除和氨基酸突變中的一種或幾種。
8、優(yōu)選的，所述替換用信號(hào)肽包括seq?id?no：10~14所示的信號(hào)肽序列中的一種；所述氨基酸突變的位點(diǎn)包括n67i，r106q，f137s，s215p和e487q中的一種或幾種。
9、優(yōu)選的，所述優(yōu)化的pref蛋白的氨基酸序列如seq?id?no：2、4、6、8所示，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列依次如seq?id?no：3、5、7、9所示。
10、優(yōu)選的，所述截短的pref△ct蛋白為c末端1~23個(gè)任意氨基酸的截短。
11、優(yōu)選的，所述截短的pref△ct蛋白的氨基酸序列如seq?id?no：15所示，所述截短的pref△ct蛋白的核苷酸序列如seq?id?no：16所示。
12、優(yōu)選的，所述ege基序包括epm、linker和eabr；所述epm為seq?id?no：18、20、22任一項(xiàng)所示的核苷酸序列；所述linker為gs?、(gs)n或(ggggs)n，其中n表示重復(fù)次數(shù)，n=1~4；所述eabr為seq?id?no：24、26、28、30、32、34、36任一項(xiàng)所示的核苷酸序列。
13、優(yōu)選的，所述epm為seq?id?no：18所示的核苷酸序列，所述linker為gs，所述eabr為seq?id?no：36所示的核苷酸序列。
14、本發(fā)明還提供了所述的一種自發(fā)形成包膜病毒樣顆粒的rsv?pref-evlp的構(gòu)建方法，將所述目的基因構(gòu)建到表達(dá)質(zhì)粒中，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)細(xì)胞收集上清，得到自發(fā)形成包膜病毒樣顆粒rsv?pref-evlp。
15、本發(fā)明還提供了一種所述的自發(fā)形成包膜病毒樣顆粒的rsv?pref-evlp中的所述截短的pref△ct蛋白的用途，所述截短的pref△ct蛋白的用途在于提高f蛋白在膜上的表達(dá)量。
16、本發(fā)明還提供了一種所述的自發(fā)形成包膜病毒樣顆粒rsv?pref-evlp構(gòu)建的rsvmrna疫苗平臺(tái)，其特征在于，所述rsv?mrna疫苗中含有所述的目的基因。
17、優(yōu)選的，所述rsv?mrna的核苷酸序列如seq?id?no：37或seq?id?no：38所示；優(yōu)化的rsv?mrna的核苷酸序列如seq?id?no：39所示。
18、本發(fā)明還提供了所述的rsv?mrna疫苗平臺(tái)的構(gòu)建方法，包括但不限于如下步驟：
19、（1）將所述目的基因或rsv?mrna的核苷酸序列構(gòu)建到表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒；
20、（2）將所述重組質(zhì)粒線性化作為轉(zhuǎn)錄模板，得到體外轉(zhuǎn)錄rsv?mrna；
21、（3）所述體外轉(zhuǎn)錄rsv?mrna經(jīng)消化、加帽、純化后，經(jīng)脂質(zhì)體包裹，得到rsv?mrna疫苗。
22、優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為pcdna3.1(+)表達(dá)質(zhì)粒，所述脂質(zhì)體為脂質(zhì)體sm102。
23、本發(fā)明還提供了所述的構(gòu)建方法獲得的脂質(zhì)體rsv?mrna疫苗，所述脂質(zhì)體rsvmrna疫苗為液體或凍干粉形式。
24、本發(fā)明還提供了一種含有所述的自發(fā)形成包膜病毒樣顆粒rsv?pref-evlp構(gòu)建的rsv?腺病毒載體疫苗。
25、優(yōu)選的，所述腺病毒載體疫苗中的腺病毒載體包括人腺病毒載體和黑猩猩腺病毒載體；所述人腺病毒載體包括但不限于人腺病毒5型、人腺病毒26型；所訴黑猩猩腺病毒載體包括但不限于adc9、adc68。
26、優(yōu)選的，所述rsv?腺病毒載體疫苗中的目的基因的核苷酸序列如seq?id?no：43或seq?id?no：45所示，氨基酸如seq?id?no：44或seq?id?no：46所示。
27、本發(fā)明還提供了所述自發(fā)形成包膜病毒樣顆粒的rsv?pref-evlp或所述的rsvmrna疫苗平臺(tái)或所述的脂質(zhì)體rsv?mrna疫苗或所述的在rsv?腺病毒載體疫苗在制備呼吸道合胞病毒疫苗中的應(yīng)用。
28、本發(fā)明提供了一種新型vlp自組裝技術(shù)，通過(guò)在pref蛋白胞質(zhì)末端通過(guò)添加ege基序引起自組裝形成evlp。而不是引入其它骨架序列共轉(zhuǎn)染形成evlp。本發(fā)明也將納米顆粒疫苗技術(shù)與現(xiàn)有的mrna疫苗平臺(tái)相結(jié)合，解決了單一的納米顆粒疫苗在細(xì)胞免疫誘導(dǎo)不強(qiáng)的科學(xué)問(wèn)題，同時(shí)充分發(fā)揮vlp疫苗在抗體應(yīng)答方面的優(yōu)勢(shì)，增強(qiáng)了mrna疫苗的b細(xì)胞免疫應(yīng)答，以解決現(xiàn)有mrna疫苗其保護(hù)性不持久的問(wèn)題。且該技術(shù)是首次運(yùn)用于rsv，而且也是第一個(gè)rsv?mrna疫苗的首次應(yīng)用。
29、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的有益效果：
30、（1）本發(fā)明成功開(kāi)發(fā)了基于rsv?pref蛋白的evlp技術(shù)，該evlp可自組裝形成，并可歸類于細(xì)胞外囊泡的一種。
31、（2）本發(fā)明成功建立evlp技術(shù)，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量抗體的產(chǎn)生，與單一的pref相比其中和抗體滴度提高了2.5~5倍。
32、（3）本發(fā)明成功的將evlp技術(shù)與mrna技術(shù)、腺病毒技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建得到依托于evlp技術(shù)的rsv?mrna疫苗平臺(tái)、腺病毒平臺(tái)，在小鼠體內(nèi)引起強(qiáng)的免疫應(yīng)答保護(hù)小鼠免受rsv攻擊。在保護(hù)劑量上，遠(yuǎn)低于pref。同時(shí)，本發(fā)明還可以將evlp技術(shù)與重組蛋白技術(shù)相結(jié)合，得到重組蛋白疫苗。
33、（4）本發(fā)明建立的evlp技術(shù)相比原始pref，其可以顯著刺激b細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括生發(fā)中心b細(xì)胞以及記憶b細(xì)胞，為進(jìn)一步探索開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效呼吸道合胞病毒疫苗提供了思路。