本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，尤其涉及一種在細(xì)胞外具有可控穿孔活性的gsdmd融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞焦亡是一種由定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的gsdmd等gasdermin蛋白家族觸發(fā)的程序性細(xì)胞壞死。gsdmd由兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域組成：n端結(jié)構(gòu)域（gsdmd-n）和c端（gsdmd-c）結(jié)構(gòu)域。其中，gsdmd-n是主要的功能結(jié)構(gòu)域，而gsdmd-c具有自抑制作用。當(dāng)gsdmd被炎性caspase蛋白酶切割后，釋放出的gsdmd-n結(jié)構(gòu)域會(huì)在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、膜穿孔以及細(xì)胞內(nèi)容物釋放，進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥和免疫反應(yīng)。

2、現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)（公開(kāi)號(hào)為cn118063584a的專利），利用基因工程在gsdmd的n端結(jié)構(gòu)域和c端結(jié)構(gòu)域之間插入組織蛋白酶d的切割位點(diǎn)形成gsdmd變體，并與抗體連接的一種gsdmd變體融合蛋白。該融合蛋白靶向特定細(xì)胞表面后被內(nèi)吞，在細(xì)胞中的組織蛋白酶d的切割作用下，釋放gsdmd-n端結(jié)構(gòu)域，從而在細(xì)胞內(nèi)膜形成孔道，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。這種方法存在的主要問(wèn)題是：該融合蛋白無(wú)法在細(xì)胞外發(fā)揮穿孔功能，必須依賴于細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程及細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶切割作用，以在細(xì)胞內(nèi)裂解出gsdmd-n端結(jié)構(gòu)域，并且細(xì)胞膜穿孔的激活過(guò)程和時(shí)間無(wú)法精準(zhǔn)控制。

3、現(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)（文獻(xiàn)doi：10.1016/j.heliyon.2024.e30444.），將her2抗體p1h3、白蛋白結(jié)合肽、組織蛋白酶b的切割位點(diǎn)、內(nèi)體破壞肽e5c3以及gsdmd-n端結(jié)構(gòu)域組成融合蛋白。該融合蛋白可特異性識(shí)別her2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞并被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入內(nèi)體后，在組織蛋白酶b的作用下被切割，釋放的gsdmd-n端結(jié)構(gòu)域在e5c3介導(dǎo)的內(nèi)體逃逸過(guò)程中進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡。然而，這一策略的主要局限在于：該融合蛋白無(wú)法在細(xì)胞外發(fā)揮穿孔功能，仍依賴于細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程及細(xì)胞內(nèi)源的切割作用，以在細(xì)胞內(nèi)裂解出gsdmd-n端結(jié)構(gòu)域，并且膜穿孔的激活過(guò)程和時(shí)間無(wú)法精準(zhǔn)控制。此外，由于設(shè)計(jì)復(fù)雜，該融合蛋白發(fā)揮活性受到諸多因素影響。

4、現(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)（文獻(xiàn)doi：10.1016/j.cell.2024.08.007.），gsdmd小分子激動(dòng)劑dmb（6,7-dichloro-2-methylsulfonyl-3-n-tert-butylaminoquinoxaline，中文為6,7-二氯-2-甲磺?；?3-n-叔丁基氨基喹喔啉），能夠直接激活細(xì)胞內(nèi)源gsdmd，而不裂解gsdmd，在細(xì)胞膜內(nèi)表面引起穿孔，引發(fā)細(xì)胞焦亡。這種方法存在的主要局限于：細(xì)胞外沒(méi)有天然存在的gsdmd，dmb的激動(dòng)效果受限于細(xì)胞內(nèi)的gsdmd，并且無(wú)法靶向特定的目標(biāo)細(xì)胞。

5、綜上所述，開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)目的細(xì)胞焦亡而殺傷腫瘤細(xì)胞的療法有望成為對(duì)抗癌癥的有力工具，是一種有前景的治療策略，具有研究重要意義。但目前的相關(guān)藥物與療法研究還處于早期階段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、現(xiàn)有的gsdmd融合蛋白技術(shù)普遍局限于：無(wú)法在細(xì)胞外發(fā)揮膜穿孔作用，依賴細(xì)胞內(nèi)吞與蛋白酶切割，需要在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)部釋放出的gsdmd-n端結(jié)構(gòu)域，而引發(fā)細(xì)胞膜穿孔與促進(jìn)細(xì)胞焦亡的方法。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供了一種在細(xì)胞外具有可控穿孔活性的gsdmd融合蛋白及應(yīng)用方案。本發(fā)明設(shè)計(jì)的gsdmd融合蛋白與應(yīng)用方案，在細(xì)胞外實(shí)現(xiàn)了gsdmd的細(xì)胞膜穿孔的功能，并且不依賴細(xì)胞內(nèi)吞，不需要被蛋白酶切割而釋放gsdmd-n端結(jié)構(gòu)域，通過(guò)與外部直接激動(dòng)劑的聯(lián)用，在特定時(shí)間與濃度下被可控地激活穿孔活性，可類比“開(kāi)關(guān)式”治療，提升臨床可控性與安全性，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)殺傷與免疫激活，顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的局限。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種在細(xì)胞外具有可控穿孔活性的gsdmd融合蛋白，具體的，將人源gsdmd蛋白多肽片段（片段a）與靶向腫瘤細(xì)胞外表面抗原的多肽片段（片段b）連接而形成一種新型融合蛋白，其中：

4、片段a為人源gsdmd蛋白序列x-y位的多肽片段，其天然處于自抑制狀態(tài)，其中，x選自1-6間的整數(shù)，y選自為479-484間的整數(shù)，包含gsdmd蛋白的n端結(jié)構(gòu)域與c端結(jié)構(gòu)域；

5、片段b為靶向識(shí)別組織或細(xì)胞的多肽片段。

6、本發(fā)明所述的融合蛋白可包括一個(gè)或多個(gè)片段a和一個(gè)或多個(gè)片段b，本發(fā)明對(duì)它們的重復(fù)數(shù)目和連接順序不做限定。當(dāng)片段重復(fù)數(shù)不為1時(shí)，兩個(gè)重復(fù)片段的序列可以相同，也可以不同，本發(fā)明對(duì)此不做限定。片段b可靶向相同的組織或細(xì)胞，也可以靶向不同的組織或細(xì)胞，本發(fā)明對(duì)此不做限定。為了保持片段a和片段b結(jié)構(gòu)的完整，融合蛋白中可以包括linker也可以不包括，本發(fā)明對(duì)此不做限定。本發(fā)明中，所述linker位于兩個(gè)相鄰的片段之間，例如片段a與片段b之間，或者兩個(gè)片段a之間，或者兩個(gè)片段b之間，本發(fā)明對(duì)此不做限定。

7、本發(fā)明還提供了所述gsdmd融合蛋白與gsdmd直接激動(dòng)劑的聯(lián)合應(yīng)用方法（圖1）。所述gsdmd直接激動(dòng)劑可以直接激活gsdmd的穿孔活性而不裂解gsdmd。具體的：表達(dá)與制備本發(fā)明所述的gsdmd融合蛋白。所述gsdmd融合蛋白在細(xì)胞外可特異性靶向目標(biāo)細(xì)胞表面抗原并聚集到目標(biāo)細(xì)胞外表面，在此狀態(tài)下，該融合蛋白通過(guò)片段b僅僅發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞外表面抗原的靶向抑制功能，但不具有細(xì)胞膜穿孔的活性，降低了對(duì)細(xì)胞的毒副作用。在指定時(shí)間，施加指定濃度的gsdmd直接激動(dòng)劑，可控的使得所述gsdmd融合蛋白的片段a在不被裂解的情況下，轉(zhuǎn)換為膜穿孔活性狀態(tài)，從而在腫瘤細(xì)胞膜外表面上成孔并誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生焦亡，達(dá)到直接殺傷腫瘤細(xì)胞和增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的治療效果。

8、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞外單獨(dú)地加入全長(zhǎng)gsdmd蛋白，或單獨(dú)地加入本發(fā)明所述gsdmd融合蛋白，皆無(wú)法引發(fā)腫瘤細(xì)胞膜穿孔。進(jìn)一步的，在腫瘤細(xì)胞外加入全長(zhǎng)gsdmd蛋白與小分子激動(dòng)劑dmb的組合，也無(wú)法引發(fā)腫瘤細(xì)胞膜穿孔。形成顯著對(duì)比的是，本發(fā)明所述gsdmd融合蛋白與直接激動(dòng)劑dmb的聯(lián)合應(yīng)用方案，可高效的在腫瘤細(xì)胞外膜上直接造成膜穿孔并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，并且在相同濃度下，所述gsdmd融合蛋白與直接激動(dòng)劑dmb的協(xié)同使用效果，顯著大于單獨(dú)使用gsdmd融合蛋白或直接激動(dòng)劑dmb的效果，從而可大幅度降低所述gsdmd融合蛋白與直接激動(dòng)劑的使用濃度，減少對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞的毒副作用，實(shí)現(xiàn)安全性和可控性地直接殺傷目的腫瘤細(xì)胞的目的。本發(fā)明設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單高效，不依賴于細(xì)胞的內(nèi)吞與細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的切割作用，發(fā)揮活性的制約因素明顯減少。進(jìn)一步的，本發(fā)明可以與其他腫瘤治療方案聯(lián)用，提升抗腫瘤的治療效果。

9、優(yōu)選的，所述人源gsdmd蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，或其變體所示的序列。

10、優(yōu)選的，選擇所述人源gsdmd蛋白序列6-479位的多肽片段，或其變體所示的序列。

11、優(yōu)選的，所述融合蛋白的片段b為靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原egfr、pdl1或her2的多肽片段，所述多肽片段來(lái)源于文獻(xiàn)報(bào)道的egfrn、靶向pdl1的納米抗體和靶向her2的基因工程改造類抗體darpin，氨基酸序列如seq?id?no.2-4所示，或其變體所示的序列。

12、在其中多個(gè)實(shí)施例中，片段b與腫瘤細(xì)胞表面抗原的高親和力結(jié)合，將所述融合蛋白聚集到腫瘤細(xì)胞表面，且仍具有阻斷表面抗原與其配體的結(jié)合的功能。

13、優(yōu)選的，所述融合蛋白的片段a與片段b通過(guò)linker鏈接，氨基酸序列如seq?idno.8所示，或其變體所示的序列。

14、優(yōu)選的，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.5-7所示，或其變體所示的序列。

15、其中，變體與其所源自的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性。

16、本發(fā)明還提供了一種組合物，所述組合物包括所述的任一gsdmd融合蛋白與gsdmd直接激動(dòng)劑，其中，所述gsdmd直接激動(dòng)劑可以直接激活gsdmd的穿孔活性而不裂解gsdmd。

17、優(yōu)選的，所述gsdmd直接激動(dòng)劑為小分子化合物6,7-二氯-2-甲磺?；?3-n-叔丁基氨基喹喔啉（6,7-dichloro-2-methylsulfonyl-3-n-tert-butylaminoquinoxaline，dmb），或具有直接激活gsdmd作用的dmb衍生物。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施例中，dmb的作用濃度為小于或等于5?μm，顯著小于其對(duì)于細(xì)胞內(nèi)源gsdmd激動(dòng)活性（ec50=5～10?μm），從而有效避免dmb對(duì)于非目標(biāo)細(xì)胞的影響，降低了細(xì)胞毒性。

18、本發(fā)明還提供了與上述的gsdmd融合蛋白相關(guān)的生物材料，所述生物材料為以下的任意一種：

19、（1）編碼上述的gsdmd融合蛋白的核酸分子；

20、（2）含有（1）所述核酸分子的表達(dá)盒；

21、（3）含有（1）所述核酸分子的重組載體、或含有（2）所述表達(dá)盒的重組載體；

22、（4）含有（1）所述核酸分子的重組微生物、或含有（2）所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有（3）所述重組載體的重組微生物；

23、（5）含有（1）所述核酸分子的細(xì)胞系、或含有（2）所述表達(dá)盒的細(xì)胞系、或含有（3）所述重組載體的細(xì)胞系。

24、具體的：

25、優(yōu)選的，一種核酸分子可編碼上述融合蛋白。

26、優(yōu)選的，一種核酸構(gòu)建體，包含上述核酸分子。

27、優(yōu)選的，一種表達(dá)載體，表達(dá)上述融合蛋白、包含上述核酸分子或者包含上述核酸構(gòu)建體。

28、優(yōu)選的，一種細(xì)胞，分泌上述融合蛋白、包含上述核酸分子、包含上述核酸構(gòu)建體或者包含上述表達(dá)載體。

29、在其中一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞包括免疫細(xì)胞。

30、在其中一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞包括t細(xì)胞。

31、在其中一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞包括基因工程改造的細(xì)胞。

32、優(yōu)選的，一種試劑盒，包含上述核酸分子、上述核酸構(gòu)建體或者上述表達(dá)載體，用于制備上述融合蛋白或上述細(xì)胞。

33、優(yōu)選的，一種藥物組合物，包含上述核酸分子、包含上述核酸構(gòu)建體、包含上述載體或包含上述細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的輔料。

34、優(yōu)選的，藥物組合物還包含抗腫瘤活性藥物。

35、優(yōu)選的，上述融合蛋白、上述核酸分子、上述核酸構(gòu)建體、上述載體、上述細(xì)胞、上述藥物組合物、上述組合物中的至少一種在制備用于在受試者中預(yù)防或治療或輔助治療癌癥、或延遲癌癥進(jìn)展、或降低或抑制癌癥復(fù)發(fā)的藥物中的用途。

36、在本發(fā)明中，所述腫瘤優(yōu)選的包括her2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞、egfr陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞和pdl1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。所述egfr陽(yáng)性腫瘤優(yōu)選的包括宮頸癌和乳腺癌，如egfr+hela、egfr+skbr3和egfr+mda-mb-231。所述her2陽(yáng)性腫瘤優(yōu)選的包括宮頸癌和乳腺癌，如her2+hela和her2+skbr3。所述pdl1陽(yáng)性腫瘤優(yōu)選的包括宮頸癌和乳腺癌，如pdl1+hela和pdl1+mda-mb-231。所述藥物中的活性成分優(yōu)選的包括上述促腫瘤焦亡蛋白或其基因、上述靶向her2、egfr和pdl1免疫促腫瘤焦亡蛋白或其基因或生物材料。

37、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述腫瘤為乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、膽管癌、胃腺癌或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

38、本發(fā)明的有益效果：

39、本發(fā)明提出并設(shè)計(jì)了一種新型的在細(xì)胞外具有可控穿孔活性的gsdmd融合蛋白與其應(yīng)用方法，所述融合蛋白在細(xì)胞外可特異性靶向目標(biāo)細(xì)胞表面抗原并聚集到目標(biāo)細(xì)胞表面，在抑制腫瘤細(xì)胞表面抗原功能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)gsdmd直接激動(dòng)劑dmb的給藥，融合蛋白可控的轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，具有誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生焦亡的有益效果，且能夠有效降低小分子藥物dmb用藥所帶來(lái)的毒副作用。在體外實(shí)驗(yàn)本發(fā)明的融合蛋白與聯(lián)合使用方法，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系均實(shí)現(xiàn)了良好的殺傷效果。相比于已有方案，本發(fā)明提出的方案可直接在細(xì)胞外發(fā)揮穿孔活性，不依賴于細(xì)胞內(nèi)吞作用，不依賴于內(nèi)源gsdmd以及gsdmd蛋白的裂解，通過(guò)與外部直接激動(dòng)劑的聯(lián)用，在特定時(shí)間與濃度下被可控地激活穿孔活性，可類比“開(kāi)關(guān)式”治療，因此對(duì)于目標(biāo)細(xì)胞具有更好的靶向性和殺傷作用，提升臨床可控性與安全性。