本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，特別涉及一種酶活提高的pet水解酶突變體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（pet）是一種廣泛應(yīng)用于包裝材料、合成纖維和塑料容器等工業(yè)領(lǐng)域的熱塑性聚酯，其具有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)惰性，難以在自然環(huán)境中降解。隨著pet制品消費(fèi)量的持續(xù)增長，其廢棄物在環(huán)境中長期累積，成為廢塑料污染的重要來源。盡管pet具有回收利用潛力，但現(xiàn)有回收方式仍存在明顯局限。目前pet的回收方式主要包括機(jī)械回收和化學(xué)回收兩類。機(jī)械回收通過物理方法實(shí)現(xiàn)pet再利用，操作簡便，但材料多次回收后性能易下降，限制了其在高性能制品中的應(yīng)用?；瘜W(xué)回收則通過水解、醇解等反應(yīng)將pet降解為其單體或低聚物，可實(shí)現(xiàn)材料的再生合成，但該類方法普遍存在工藝條件苛刻、能耗高及副產(chǎn)物處理難度大的問題。
2、相較而言，酶催化降解pet因具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物明確、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在相關(guān)領(lǐng)域被提出作為替代方案。已知pet水解酶（petase）可在適宜溫度和ph條件下斷裂pet分子中的酯鍵，生成對(duì)苯二甲酸（tpa）與乙二醇（eg）等降解產(chǎn)物。已有研究表明，來源于 ideonella?sakaiensis的petase與mhetase可協(xié)同實(shí)現(xiàn)pet的分解，在生物催化降解技術(shù)中具有代表性。然而，天然petase在酶催化效率、熱穩(wěn)定性和底物適應(yīng)能力等方面仍存在不足，難以適應(yīng)高底物濃度、長時(shí)間反應(yīng)或較高溫度等工業(yè)條件。為提升其性能，已有研究采用定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)等酶工程方法開發(fā)改良型酶變體，其中以fast-petase為代表的突變體在活性與穩(wěn)定性方面均較天然酶有所改善，已成為當(dāng)前酶法pet降解技術(shù)中的重要工具（lu?h.,?diaz?d.?j.,?cuisinier?m.,?et?al.?machine?learning-aided?engineeringofhydrolases?for?pet?depolymerization?[j].?nature,?2022,?604(7907):?662-667.）。但fast-petase在特定應(yīng)用環(huán)境下仍存在反應(yīng)效率不足、酶穩(wěn)定性優(yōu)化空間有限等問題，尚需進(jìn)一步優(yōu)化其性能，以滿足實(shí)際應(yīng)用需求。
3、鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種酶活提高的pet水解酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明結(jié)合深度學(xué)習(xí)模型設(shè)計(jì)與酶工程優(yōu)化策略，開發(fā)了更適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用需求的高性能pet水解酶突變體。
2、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
3、一種酶活提高的pet水解酶突變體，其氨基酸序列為seq?id?no.1經(jīng)如下任意一種突變而得：
4、s213t、t140d\s213t、s169a\s213t或n212e\s213t；其中，s213t，即第213位氨基酸由s突變?yōu)閠，其他同理；
5、一種所述突變體的編碼基因。
6、上述突變體相關(guān)的生物材料，為下述生物材料中的任意一種或多種組合：
7、（1）含有上述編碼基因的表達(dá)盒；
8、（2）含有上述編碼基因的重組表達(dá)載體；
9、（3）含有（1）中所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體；
10、（4）含有上述編碼基因的重組菌；
11、（5）含有（1）中所述表達(dá)盒的重組菌；
12、（6）含有（2）或（3）中所述重組表達(dá)載體的重組菌。
13、進(jìn)一步的，（2）、（3）中所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pet系列的載體或ppiczα載體等；優(yōu)選為pet-22a(+)載體或ppiczαa載體。
14、進(jìn)一步的，（4）、（5）、（6）中所述重組菌對(duì)應(yīng)的宿主菌選自原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞等；所述原核生物包括埃希氏菌屬（ escherichia）、芽孢桿菌屬（ bacillus）、沙門氏菌屬（ salmonella）、假單胞菌屬（ pseudomonas）或鏈霉菌屬（ streptomyces）等細(xì)菌；所述酵母包括畢赤酵母等酵母。更具體而言，所述原核生物是埃希氏菌屬，優(yōu)選大腸桿菌（ escherichia?coli， e.?coli），具體可為大腸桿菌bl21(de3)或大腸桿菌origami?2(de3)；所述酵母是畢赤酵母x33或gs115。
15、上述突變體、編碼基因、突變體相關(guān)的生物材料在制備酶活提高的pet水解酶突變體中的應(yīng)用。
16、進(jìn)一步的，上述突變體、編碼基因、突變體相關(guān)的生物材料在降解pet中的應(yīng)用。
17、優(yōu)選的，所述pet的結(jié)晶度為20%以下，進(jìn)一步為5～20%，再進(jìn)一步為6～8%；更進(jìn)一步為6.7%。
18、一種獲得上述突變體的方法，包括如下步驟：通過定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的pet水解酶的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后表達(dá)，得到pet水解酶突變體。
19、進(jìn)一步的，通過定點(diǎn)突變技術(shù)向編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的pet水解酶的基因中引入突變，經(jīng)測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到pet水解酶突變體。
20、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
21、本發(fā)明從fast-petase出發(fā)，基于深度學(xué)習(xí)的設(shè)計(jì)、酶工程優(yōu)化及應(yīng)用展開研究。首先，采用cpd-resnet50深度學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)并結(jié)合人工評(píng)估，選擇了11個(gè)可能提升酶性能的待驗(yàn)證單點(diǎn)突變體，隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、酶工程改造。構(gòu)建基于分泌表達(dá)體系和模式底物4-硝基苯基乙酸酯（ p-npa）的高通量petase酶活篩選方法，以相對(duì)酶活大于0.5（突變體/fast-petase）和相對(duì)熱穩(wěn)定性大于1.0（突變體/fast-petase）為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出8個(gè)優(yōu)勢(shì)單點(diǎn)突變體；進(jìn)而構(gòu)建并評(píng)估含2～8個(gè)突變位點(diǎn)的247個(gè)組合突變體文庫，綜合挑選較優(yōu)的單點(diǎn)突變體和組合突變體，以非晶態(tài)pet膜（amopet，結(jié)晶度6.7%）為底物進(jìn)行評(píng)估獲優(yōu)勢(shì)突變體?；诳汕懈钭跃奂瘶?biāo)簽法（csat?2.0）高效表達(dá)純化了該優(yōu)勢(shì)突變體，最優(yōu)突變體t140d\s213t酶活是fast-petase的2倍，在50℃熱處理2小時(shí)后的熱穩(wěn)定性與fast-petase相當(dāng)。對(duì)最優(yōu)突變體t140d\s213t進(jìn)行蛋白質(zhì)熔解溫度（tm）測(cè)試顯示，其tm提高1℃。
1.一種酶活提高的pet水解酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列為seq?idno.1經(jīng)如下任意一種突變而得：
2.一種編碼權(quán)利要求1所述酶活提高的pet水解酶突變體的基因。
3.權(quán)利要求1所述酶活提高的pet水解酶突變體相關(guān)的生物材料，其特征在于，為下述生物材料中的任意一種或多種組合：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物材料，其特征在于：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于：
6.權(quán)利要求1所述酶活提高的pet水解酶突變體、權(quán)利要求2所述基因或權(quán)利要求3～5任一項(xiàng)所述生物材料在制備酶活提高的pet水解酶突變體中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述酶活提高的pet水解酶突變體、權(quán)利要求2所述基因或權(quán)利要求3～5任一項(xiàng)所述生物材料在降解pet中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述pet的結(jié)晶度為20%以下。
9.一種獲得權(quán)利要求1所述酶活提高的pet水解酶突變體的方法，其特征在于，包括如下步驟：通過定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的pet水解酶的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后表達(dá)，得到權(quán)利要求1所述酶活提高的pet水解酶突變體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，通過定點(diǎn)突變技術(shù)向編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的pet水解酶的基因中引入突變，經(jīng)測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到權(quán)利要求1所述酶活提高的pet水解酶突變體。