本發(fā)明屬于生物，具體涉及抗裂谷熱病毒gn蛋白的單抗及在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、裂谷熱是一種人獸共患蚊媒傳染病。裂谷熱臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛和肌肉關(guān)節(jié)痛，重癥病例可累及多臟器，病死率高。目前沒(méi)有上市人用疫苗和特異性治療藥物。

2、裂谷熱的病原體是裂谷熱病毒（rift?valley?fever?virus；rvfv），rvfv基因組為單負(fù)鏈rna病毒，由l、m、s?3個(gè)片段組成，其中l(wèi)片段編碼rna多聚酶。m片段編碼包膜糖蛋白gn和gc，gn主要負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合，而gc在膜融合中發(fā)揮關(guān)鍵作用。病毒進(jìn)入機(jī)體后，首先在侵入的局部組織中復(fù)制，通過(guò)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)進(jìn)一步復(fù)制，繼而進(jìn)入血循環(huán)形成病毒血癥，一般持續(xù)4~7天，后可出現(xiàn)發(fā)熱等感染中毒癥狀，并可引起多臟器局灶性感染。

3、目前，病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒分離、核酸檢測(cè)、抗原檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)等。其中病毒分離是病毒感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的條件要求較高且需要較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。盡管病毒核酸的檢測(cè)方法比傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)法靈敏、快速，但對(duì)設(shè)備和人員要求較高。血清igm檢測(cè)在感染病毒后5-6天才開(kāi)始出現(xiàn)，igg在感染病毒后14天出現(xiàn)，不能實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。建立一種簡(jiǎn)便易行的能夠特異性檢測(cè)裂谷熱病毒感染早期的診斷試劑勢(shì)在必行，對(duì)于可疑感染人群的快速檢測(cè)具有意義。

4、裂谷熱病毒的gn蛋白是一種相對(duì)保守的包膜糖蛋白，主要在感染細(xì)胞中高度表達(dá)，具有很強(qiáng)的抗原性，存在于病毒感染患者或感染動(dòng)物的早期外周血中，因此檢測(cè)急性期病人血清中的gn抗原可用于早期診斷裂谷熱病毒感染。

5、裂谷熱病毒gn蛋白是由裂谷熱病毒的m基因編碼，介導(dǎo)病毒的受體識(shí)別過(guò)程。gn蛋白是i型跨膜蛋白，是通過(guò)c端的螺旋結(jié)構(gòu)錨定在病毒顆粒的膜表面。gn蛋白的胞外區(qū)可以分為head區(qū)（154-469aa）和stem區(qū)（470-582aa）。研究報(bào)道，gn蛋白的中和表位主要集中于head區(qū)，head區(qū)由三個(gè)區(qū)域構(gòu)成，分別為domain?i、domain?ii和domain?iii。目前，已知的裂谷熱病毒中和抗體主要結(jié)合區(qū)域?yàn)閐omain?i和domain?iii。

6、抗原捕獲elisa法來(lái)檢測(cè)病毒的方法可分為兩類，一類是以多克隆抗體的為捕獲抗體或檢測(cè)抗體，這類方法在不同批次的抗血清中存在很大差異，難以重復(fù)和實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化。另一類利用單克隆抗體來(lái)檢測(cè)病毒，當(dāng)前尚無(wú)利用抗gn的單克隆抗體來(lái)檢測(cè)裂谷熱病毒的商品化試劑盒。

7、公開(kāi)號(hào)為cn114409770a的發(fā)明申請(qǐng)公開(kāi)了一種裂谷熱病毒人源單克隆抗體及其應(yīng)用，其中公開(kāi)了8株人源單克隆抗體，可以有效治療被rvfv感染的小鼠，預(yù)防rvfv對(duì)小鼠的感染。但是該單克隆抗體用于治療，并未公開(kāi)可以用于elisa檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種基于2株高結(jié)合活性單克隆抗體a1和c1，建立雙抗體夾心elisa法檢測(cè)裂谷熱病毒gn抗原。本發(fā)明試劑盒中，單抗a1和單抗c1，均是人igg1亞類的免疫球蛋白，兩種單抗均能特異性結(jié)合裂谷熱病毒gn抗原。所述的單抗采用腺病毒載體裂谷熱候選疫苗和重組gn抗原免疫恒河猴，從外周血中利用流式分選-單細(xì)胞pcr技術(shù)篩選獲得高結(jié)合活性單抗可變區(qū)基因，經(jīng)基因工程技術(shù)獲得兩種人igg1亞類重組單克隆抗體a1和c1。

2、本發(fā)明首先提供了抗裂谷熱病毒gn蛋白的單抗，為單抗a1和/或單抗c1，

3、其中，單抗a1的重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:1所示序列第26-33、51-58、97-115位氨基酸序列所示；輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:2所示序列第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列所示；

4、單抗c1的重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:3所示序列第26-33、51-58、97-101位氨基酸序列所示；輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:4所示序列第27-38、56-58、95-103位氨基酸序列所示。

5、其中，單抗a1和/或單抗c1表示為單抗a1和單抗c1中的一個(gè)或者兩者的組合。

6、優(yōu)選的，單抗a1的重鏈的氨基酸序列如seq?id?no:1所示，輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

7、優(yōu)選的，單抗c1的重鏈的氨基酸序列如seq?id?no:3所示，輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no:4所示。

8、本發(fā)明又提供了編碼所述抗裂谷熱病毒gn蛋白的單抗的編碼基因，編碼單抗a1的重鏈的基因序列如seq?id?no:5所示，編碼單抗a1的輕鏈的基因序列如seq?id?no:6所示；

9、編碼單抗c1的重鏈的基因序列如seq?id?no:7所示，編碼單抗c1的輕鏈的基因序列如seq?id?no:8所示。

10、本發(fā)明還提供了所述抗裂谷熱病毒gn蛋白的單抗在制備用于檢測(cè)裂谷熱病毒gn抗原的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)裂谷熱病毒gn抗原的檢測(cè)試劑盒，包括所述抗裂谷熱病毒gn蛋白的單抗。當(dāng)單抗為單抗a1或單抗c1中的一種時(shí)，可以直接使用westernblotting等檢測(cè)方法檢測(cè)，也可以再另外搭配一種特異性結(jié)合抗體恒定區(qū)的二抗進(jìn)行elisa等檢測(cè)方法檢測(cè)。當(dāng)單抗為單抗a1和單抗c1的組合時(shí)，可以使用雙抗夾心elisa檢測(cè)方法檢測(cè)。

12、優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒為雙抗夾心elisa檢測(cè)試劑盒，其中單抗為單抗a1和單抗c1，單抗a1和單抗c1中一個(gè)作為捕獲抗體，另一個(gè)作為檢測(cè)抗體，所述檢測(cè)抗體經(jīng)過(guò)標(biāo)記。

13、捕獲抗體用于結(jié)合抗原以捕獲待檢測(cè)的抗原；檢測(cè)抗體用于在使用捕獲抗原捕獲到抗原后，檢測(cè)抗體再結(jié)合抗原并用于通過(guò)顯色或熒光等手段進(jìn)行檢測(cè)。可以是單抗a1作為捕獲抗體，單抗c1作為檢測(cè)抗體，也可以反過(guò)來(lái)單抗a1作為檢測(cè)抗體，單抗c1作為捕獲抗體。

14、優(yōu)選的，檢測(cè)抗體中用于標(biāo)記單抗的標(biāo)記物為過(guò)氧化物酶、磷酸酯酶或熒光素酶。

15、更優(yōu)選的，所述過(guò)氧化物酶為辣根過(guò)氧化物酶。

16、本發(fā)明還提供了所述檢測(cè)試劑盒在非診斷為目的、檢測(cè)裂谷熱病毒gn抗原中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明還提供了一種非診斷為目的、檢測(cè)裂谷熱病毒gn抗原的雙抗夾心elisa檢測(cè)方法，使用所述檢測(cè)試劑盒，所述雙抗夾心elisa檢測(cè)方法包括以下步驟：

18、s1，使用捕獲抗體包被酶標(biāo)板；

19、s2，使用封閉液進(jìn)行封閉；

20、s3，棄去封閉液，使用緩沖液清洗，然后加入待檢測(cè)樣本，并孵育；

21、s4，使用緩沖液清洗，然后加入檢測(cè)抗體，并孵育；

22、s5，顯色并檢測(cè)。

23、優(yōu)選的，所述雙抗夾心elisa檢測(cè)方法包括以下步驟：

24、（1）包被：?jiǎn)慰寺】贵wa1用包被緩沖液稀釋成2?μg/ml后包被于酶標(biāo)板，100?μl/孔，4℃過(guò)夜；

25、（2）封閉：用pbst洗板4次，加入pbs配制的5%脫脂奶粉，100?μl/孔，37℃封閉2?h；

26、（3）加樣：棄去封閉液，用pbst洗板4次，加入待檢樣本，37℃孵育60?min；

27、（4）加酶標(biāo)抗體：用pbst洗板4次，加入1%bsa稀釋后的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體c1（0.5?μg/ml），100?μl/孔，37℃反應(yīng)60?min；

28、（5）顯色：用pbst洗板4次，加入單組分tmb顯色液，100?μl/孔，37℃避光顯色10min；

29、（6）終止：加入2?m?h2so4終止反應(yīng)，50?μl/孔；

30、（7）讀值：酶標(biāo)儀測(cè)定od450-630nm。

31、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以待測(cè)樣本的od450-630nm（s）和陰性對(duì)照的od450-630nm（n）的比值作為判定陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)s/n≥2.1時(shí)，判定為陽(yáng)性，即待檢樣品中含有裂谷熱病毒，否則判為陰性，即待檢樣品中不含有裂谷熱病毒。

32、本發(fā)明中所述的捕獲抗體a1和檢測(cè)抗體c1是從一組抗裂谷熱病毒gn蛋白的單克隆抗體中篩選出來(lái)的，能特異性結(jié)合裂谷熱病毒，而同其它布尼亞病毒屬病毒如發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒無(wú)交叉反應(yīng)，且對(duì)裂谷熱病毒具有很高的敏感度，有利于裂谷熱病毒的早期診斷。同時(shí)，該方法中的單抗序列明確，可以通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵獲得，無(wú)需動(dòng)物飼養(yǎng)和腹水提取過(guò)程，成本低。

33、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

34、本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)裂谷熱病毒gn抗原的雙抗夾心elisa檢測(cè)試劑盒，使用該試劑盒進(jìn)行雙抗夾心elisa檢測(cè)時(shí)，能特異性的檢測(cè)裂谷熱病毒gn抗原，與其他布尼亞病毒屬病毒如發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒gn抗原無(wú)交叉反應(yīng)，單抗序列明確，所用單抗可規(guī)模化培養(yǎng)制備，靈敏度高，檢測(cè)限781?pg/ml。