本發(fā)明涉及一種高活性及熱穩(wěn)定裂解性多糖單加氧酶突變體的構(gòu)建及其應用，屬于酶工程和。

背景技術(shù)：

1、纖維素是一種可再生的非化石碳源，豐富存在于地球上，是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的主要成分之一，通常存在于植物細胞壁中。作為一種由β-糖苷鍵連接的d-葡萄糖單元構(gòu)成的線性聚合物，纖維素具有重要的生物學意義。然而，纖維素卻是所有植物細胞壁多糖中最難降解的，這使得其降解過程成為一項極具挑戰(zhàn)性的任務。纖維素轉(zhuǎn)化為單糖的過程，尤其是在生物乙醇生產(chǎn)中的應用，引起了廣泛關(guān)注，因為它為應對全球能源需求的增長提供了一種環(huán)保且可持續(xù)的解決方案，而這一需求則是由工業(yè)發(fā)展和城市化進程所推動的。

2、纖維素的酶解水解過程涉及三種關(guān)鍵的纖維素酶：內(nèi)切葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶/外切葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，這三類酶協(xié)同作用，共同分解纖維素。內(nèi)切葡萄糖苷酶通過隨機切割纖維素的內(nèi)部糖苷鍵，使聚合物長度迅速縮短；外切葡萄糖苷酶則通過水解纖維素鏈的還原端或非還原端，釋放出還原糖。纖維二糖和寡糖等中間產(chǎn)物會進一步被β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖。然而，由于纖維素結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶區(qū)域非常堅固，普通的纖維素酶對其作用效果有限，導致酶解過程受阻。

3、自2010年裂解性多糖單加氧酶(lytic?polysaccharide?monooxygenases，lpmos)被發(fā)現(xiàn)以來，這一限制得到了有效改善，特別是aa9家族的lpmos。aa9?lpmos并不直接水解多糖，而是通過氧化性裂解纖維素中的抗性區(qū)域，在其結(jié)晶表面形成孔隙，從而破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)變化使得其他糖苷水解酶(如內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶)更容易接觸到多糖，從而與纖維素酶協(xié)同作用，實現(xiàn)更高效的纖維素水解。

4、在工業(yè)應用中，酶的穩(wěn)定性和催化活性是最為關(guān)鍵的酶學參數(shù)，它們直接決定了工藝的經(jīng)濟可行性。目前，aa9?lpmos大多來源于野生型酶，這些酶的熱穩(wěn)定性和催化活性尚未充分發(fā)揮其潛力，因此，為了滿足工業(yè)應用的需求，通常需要通過蛋白質(zhì)工程等手段對其進行優(yōu)化?；谟嬎銠C輔助設計的理性設計方法已被廣泛應用，以識別關(guān)鍵氨基酸并進行定向進化，從而提高aa9?lpmos的熱穩(wěn)定性和催化活性。

5、通過對aa9?lpmos進行改造，提升其熱穩(wěn)定性和催化活性，不僅能夠增強與纖維素酶的協(xié)同水解作用，還能使纖維素酶在降解木質(zhì)纖維素時更加高效，并降低酶的使用量，從而降低成本，進一步提高工業(yè)應用中的經(jīng)濟效益。因此，迫切需要開發(fā)具有更高活性和更好熱穩(wěn)定性的裂解性多糖單加氧酶突變體，以增強酶活性和協(xié)同作用，進而提高對不同纖維素底物的酶解率。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決裂解性多糖單加氧酶酶活低、協(xié)同纖維素酶酶解率低的問題，本發(fā)明提供了一種裂解性多糖單加氧酶突變體，與野生型裂解性多糖單加氧酶相比，突變體酶活提高；在協(xié)同酶解磷酸腫脹纖維素、微晶纖維素和預處理的甘蔗渣時，酶解率提高。

2、本發(fā)明的第一個目的是提供一種裂解性多糖單加氧酶突變體，其特征在于，所述裂解性多糖單加氧酶突變體是在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的基礎(chǔ)上，第32位、第56位、第60位、第63位、第72位、第79位、第80位、第84位、第90位、第98位、第104位、第107位、第120位、第121位、第128位、第137位、第143位、第154位、第160位、第170位或第175位具有一個或多個氨基酸突變。

3、在一種實施方式中，所述裂解性多糖單加氧酶突變體以來源于嗜熱毀絲霉菌的裂解性多糖單加氧酶mtlpmo9v(genbank:aeo55082.1)。

4、在一種實施方式中，裂解性多糖單加氧酶mtlpmo9v的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，其中，前21個氨基酸為信號肽，第22位的氨基酸開始至結(jié)束為從成熟酶序列。

5、在一種實施方式中，以裂解性多糖單加氧酶mtlpmo9v的氨基酸的第22位作為裂解性多糖單加氧酶野生型(wt)的第一個氨基酸，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

6、在一種實施方式中，所述裂解性多糖單加氧酶突變體對應于seq?id?no.1所示氨基酸序列，

7、所述第32位的甘氨酸是突變?yōu)榻z氨酸，命名為g32s；

8、所述第56位的蘇氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?，命名為t56c；

9、所述第60位的天冬氨酸是突變?yōu)槔野彼?，命名為d60y；

10、所述第63位的天冬氨酸是突變?yōu)榱涟彼幔麨閐63l；

11、所述第72位的脯氨酸是突變?yōu)槔i氨酸，命名為p72v；

12、所述第79位的蘇氨酸是突變?yōu)槔i氨酸，命名為t79v；

13、所述第80位的絲氨酸是突變?yōu)楫惲涟彼?，命名為s80i；

14、所述第84位的絲氨酸是突變?yōu)槔i氨酸，命名為s84v；

15、所述第90位的纈氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?，命名為v90c；

16、所述第98位的丙氨酸是突變?yōu)楦彼幔麨閍98p；

17、所述第104位的天冬氨酸是突變?yōu)榈鞍彼?，命名為d104m；

18、所述第107位的脯氨酸是突變?yōu)榱涟彼幔麨閜107l；

19、所述第120位的谷氨酰胺是突變?yōu)槔野彼幔麨閝120y；

20、所述第121位的精氨酸是突變?yōu)槔i氨酸，命名為r121v；

21、所述第128位的天冬氨酸是突變?yōu)楦彼幔麨閐128p；

22、所述第137位的谷氨酰胺是突變?yōu)楫惲涟彼?，命名為q137i；

23、所述第143位的脯氨酸是突變?yōu)樘於０坊虮彼?，分別命名為p143n和p143a；

24、所述第154位的丙氨酸是突變?yōu)楦彼幔麨閍154p；

25、所述第160位的天冬氨酸是突變?yōu)楦拾彼幔麨閐160g；

26、所述第170位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?，命名為a170c；

27、所述第175位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?，命名為a175c。

28、在一種實施方式中，所述裂解性多糖單加氧酶突變體，同時存在如下突變：

29、所述第170位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?75位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?，命名為a170c/a175c；

30、優(yōu)選地，所述第170位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼帷⑺龅?75位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?2位的甘氨酸是突變?yōu)榻z氨酸，命名為a170c/a175c/g32s；

31、優(yōu)選地，所述第170位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼帷⑺龅?75位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?07位的脯氨酸是突變?yōu)榱涟彼?，命名為a170c/a175c/p107l；

32、優(yōu)選地，所述第170位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?75位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?20位的谷氨酰胺是突變?yōu)槔野彼幔麨閍170c/a175c/q120y；

33、優(yōu)選地，所述第170位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?75位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?37位的谷氨酰胺是突變?yōu)楫惲涟彼?，命名為a170c/a175c/q137i；

34、優(yōu)選地，所述第170位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?75位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼帷⑺龅?54位的丙氨酸是突變?yōu)楦彼?，命名為a170c/a175c/a154p；

35、優(yōu)選地，所述第170位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼?、所述?75位的丙氨酸是突變?yōu)榘腚装彼帷⑺龅?60位的天冬氨酸是突變?yōu)楦拾彼?，命名為a170c/a175c/d160g。

36、在一種實施方式中，突變體a170c/a175c/q120y的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

37、本發(fā)明的第二個目的是提供任一上述的裂解性多糖單加氧酶突變體的多核苷酸。

38、本發(fā)明的第三個目的是提供上述的多核苷酸的載體。

39、在一種實施方式中，所述載體包括ppic系列載體、ppicz系列載體、ppiczα、pet系列載體；

40、可選地，ppic系列載體包括ppic9、ppic9k和ppic3.5k等；ppicz系列載體包括ppicza、ppiczb、ppiczc等；ppiczα系列載體包括ppiczαa、ppiczαb、ppiczαc等；pet系列載體包括pet-22b。

41、本發(fā)明的第四個目的是提供表達任一上述裂解性多糖單加氧酶突變體的細胞；

42、在一種實施方式中，所述細胞包括畢赤酵母、大腸桿菌、釀酒酵母和絲狀真菌；

43、可選地，絲狀真菌包括黑曲霉、米曲霉等。

44、本發(fā)明的第五個目的是提供任一上述的裂解性多糖單加氧酶突變體或上述的多核苷酸或上述的多核苷酸的載體或上述的細胞在水解纖維素中的應用。

45、本發(fā)明的第六個目的是提供一種水解纖維素的方法，使用任一上述的裂解性多糖單加氧酶突變體和纖維素酶協(xié)同酶解；

46、可選地，所述纖維素酶包括嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶或纖維素酶。

47、在一種實施方式中，所述嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶為dtcela，氨基酸序列如seq?id?no.5所示。

48、在一種實施方式中，所述纖維素酶包括商用的纖維素酶，例如，celluclast或ctec2。

49、在一種實施方式中，所述纖維素包括預處理蔗渣、磷酸腫脹纖維素、微晶纖維素。

50、在一種實施方式中，預處理蔗渣為堿處理蔗渣和酸處理蔗渣，制備方法包括：

51、將烘干的甘蔗、甘油、naoh(或硫酸)混合，加熱攪拌，過濾洗滌，制備得到堿處理蔗渣(酸處理蔗渣)。

52、在一種實施方式中，裂解性多糖單加氧酶突變體的添加量為0.2～2mg/g干基底物；纖維素酶(裂解性多糖單加氧酶和商用纖維素酶總量)的添加量為4～10mg/g干基底物。

53、在一種實施方式中，纖維素的添加量為0.5～2％w/v。

54、在一種實施方式中，酶解條件是45～50℃酶解12～96h。

55、在一種實施方式中，以2％w/v的mcc(或酸催化甘油預處理底物)作為底物時，1mm沒食子酸(當?shù)孜餅閙cc時不添加)，裂解性多糖單加氧酶突變體添加量是0.4mg/g，纖維素酶為9.6mg/g干基質(zhì)酶混合物的celluclast?1.5l，反應96h，葡萄糖產(chǎn)率達到77％(底物為酸催化甘油預處理底物時，葡萄糖產(chǎn)率達到74％)；

56、以2％w/v的mcc(或酸催化甘油預處理底物)作為底物時，1mm沒食子酸(當?shù)孜餅閙cc時不添加)，裂解性多糖單加氧酶突變體添加量是0.4mg/g，纖維素酶為4.27mg/g干基質(zhì)酶混合物的ctec2，反應72h，葡萄糖產(chǎn)率達到81％(底物為酸催化甘油預處理底物時，葡萄糖產(chǎn)率達到74％)。

57、在一種實施方式中，以2％w/v的堿催化甘油預處理底物作為底物時，1mm沒食子酸，裂解性多糖單加氧酶突變體添加量是0.2mg/g，纖維素酶為9.8mg/g干基質(zhì)酶混合物的celluclast?1.5l，反應96h，葡萄糖產(chǎn)率達到86％；

58、以2％w/v的堿催化甘油預處理底物作為底物時，1mm沒食子酸，裂解性多糖單加氧酶突變體添加量是0.2mg/g，纖維素酶為4.47mg/g干基質(zhì)酶混合物的ctec2，反應72h，葡萄糖產(chǎn)率達到77％。

59、有益效果

60、本發(fā)明以裂解性多糖單加氧酶mtlpmo9v為野生型，通過對裂解性多糖單加氧酶mtlpmo9v的不同位點進行點突變，突變后酶活提高了88％以上，并提高了裂解性多糖單加氧酶與纖維素酶協(xié)同酶解不同纖維素底物的效果。

61、突變體a170c/a175c/q120y的效果最好，具體如下：

62、(1)本發(fā)明的裂解性多糖單加氧酶突變體a170c/a175c/q120y(m3)在標準條件下酶活較野生型提高88％，酶活達到63.4u/g；

63、(2)本發(fā)明的裂解性多糖單加氧酶突變體a170c/a175c/q120y(m3)在協(xié)同嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶dtcela解磷酸腫脹纖維素和微晶纖維素時，與野生型相比，具有更好的協(xié)同效果，最高協(xié)同度可達155％和133％(野生型分別為127％和120％)；

64、(3)本發(fā)明的裂解性多糖單加氧酶突變體a170c/a175c/q120y(m3)協(xié)同纖維素酶celluclast1.5l水解微晶纖維素和酸/堿催化下甘油預處理甘蔗渣底物時表現(xiàn)出更高的協(xié)同效果，96h葡萄糖產(chǎn)率從58％、56％和61％分別提高至77％、74％和86％(野生型為70％、66％和78％)；協(xié)同ctec?2水解微晶纖維素和酸堿催化下甘油預處理甘蔗渣底物時同樣表現(xiàn)出更好的協(xié)同效果，72h葡萄糖產(chǎn)率從60％、61％和66％分別提高至81％、74％和86％(野生型為75％、65％和77％)。