本發(fā)明涉及醫(yī)藥，具體涉及一種水蛭和螞蟥及其近緣混偽品的凝膠電泳鑒別方法及其應用。

背景技術(shù)：

1、中藥水蛭來源于水蛭科動物螞蟥(whitmania?pigra?whitman)、水蛭(hirudonipponica?whitman)或柳葉螞蟥(whitmania?acranulata?whitman)的干燥體，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，中藥水蛭具有抗凝血、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗腫瘤、抗炎、改善血液流變學、保護腦缺血再灌注損傷等多種作用。水蛭動物分布于世界各地多達680余種，其中中國有100多種，而中藥水蛭的法定基原僅三種，即水蛭、螞蟥、柳葉螞蟥，且螞蟥是市場流通的主流品種，水蛭少見，柳葉螞蟥罕見。

2、近年來，隨著水蛭藥材需求量的不斷擴大，其價格逐年上升，且供不應求，混偽摻雜現(xiàn)象極為普遍。摻偽蛭類主要為菲牛蛭(poecilobdella?manillensis?lesson)、棒紋牛蛭(poecilobdella?javanica?wahlberg)及日本類蛭(mimobdella?japonica?blanchard)。盡管上述不同基原動物在形態(tài)學上可辯，但中藥水蛭常以水蛭段或粉末入藥，難以通過形態(tài)特征辨別真?zhèn)?，因此亟需建立簡便、有效的辨別方法保障流通環(huán)節(jié)水蛭藥材的質(zhì)量。

3、作為動物藥材，除小分子化合物外，水蛭含有大量蛋白多肽及游離氨基酸類成分。目前已從水蛭中分離鑒定60余個蛋白，具有抗凝血、纖溶、胰蛋白酶抑制等活性。此外，水蛭中還富含與抗凝血、抗血栓、抗血小板聚集、神經(jīng)保護特性相關(guān)的多肽。目前，利用水蛭中的大分子成分鑒別藥材真?zhèn)蔚难芯枯^少。電泳技術(shù)是分析蛋白類成分的常用方法，已在阿膠、鹿茸、蛤蟆油、蜥蜴等多種動物類藥材大分子成分的鑒別中應用，但現(xiàn)有研究中，尚未見用于區(qū)分(鑒別)水蛭和螞蟥及其近緣混偽品的凝膠電泳鑒別方法及其應用。

4、因此，本發(fā)明通過凝膠電泳鑒別方法表征大分子化合物，用于鑒別水蛭和螞蟥及其近緣混偽品。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明提供了一種水蛭和螞蟥及其近緣混偽品的凝膠電泳鑒別方法，該鑒別方法包括如下步驟：

2、(1)將待測蛭樣品進行前處理得到待測蛭樣品供試品溶液，將對照藥材進行前處理得到對照藥材溶液；其中，該對照藥材為水蛭、螞蟥和/或其近緣混偽品；其中，該水蛭和該螞蟥為水蛭科水蛭(hirudo?nipponica?whitman)和水蛭科螞蟥(whitmaniapigrawhitman)，該近緣混偽品為醫(yī)蛭科菲牛蛭(poecilobdella?manillensis?lesson)、醫(yī)蛭科棒紋牛蛭(poecilobdellajavanica?wahlberg)和/或沙蛭科日本類蛭(mimobdellajaponica?blanchard)；

3、(2)將該待測蛭樣品供試品溶液和該對照藥材溶液進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠成像分析，得到待測蛭樣品凝膠電泳圖譜以及對照藥材凝膠電泳圖譜；以及

4、(3)將該待測蛭樣品凝膠電泳圖譜與該對照藥材凝膠電泳圖譜進行對比，根據(jù)對比結(jié)果確定該待測蛭是否為水蛭、螞蟥或其近緣混偽品；

5、其中，該待測蛭選自以下的一種或多種：水蛭、螞蟥、菲牛蛭、棒紋牛蛭和日本類蛭。

6、進一步地，該對比為蛋白條帶的數(shù)量和位置的對比。

7、進一步地，該對照藥材溶液的制備方法包括：取適量的對照藥材，粉碎，過篩，得到該對照藥材粉末，向該對照藥材粉末中加入溶劑提取，振蕩搖勻，離心，取上清液，將該上清液稀釋，得到該對照藥材溶液。

8、進一步地，該篩為三號篩。

9、進一步地，該溶劑為氯化鈉溶液。

10、進一步地，該氯化鈉溶液的濃度為0.5％～2.0％，例如約0.9％。

11、進一步地，該提取為浸漬提取。

12、進一步地，該浸漬提取的時間為20～40min，例如約30min。

13、進一步地，該離心的轉(zhuǎn)速為10000～15000r/min，例如約12000r/min。

14、進一步地，該離心的時間為5～20min，例如約10min。

15、進一步地，該稀釋的倍數(shù)為5～120，例如約10或約100。

16、進一步地，該待測蛭樣品供試品溶液的制備方法包括：取適量的待測蛭樣品，粉碎，過篩，得到該待測蛭樣品粉末，向該待測蛭樣品粉末中加入溶劑提取，振蕩搖勻，離心，取上清液，將該上清液稀釋，得到該待測蛭樣品供試品溶液。

17、進一步地，該篩為三號篩。

18、進一步地，該溶劑為氯化鈉溶液。

19、進一步地，該氯化鈉溶液的濃度為0.5％～2.0％，例如約0.9％。

20、進一步地，該提取為浸漬提取。

21、進一步地，該浸漬提取的時間為20～40min，例如約30min。

22、進一步地，該離心的轉(zhuǎn)速為10000～15000r/min，例如約12000r/min。

23、進一步地，該離心的時間為5～20min，例如約10min。

24、進一步地，該稀釋的倍數(shù)為5～120，例如約10或約100。

25、進一步地，當該待測蛭為水蛭(hirudo?nipponica?whitman)或菲牛蛭時，該稀釋的倍數(shù)為約100倍。

26、進一步地，當該待測蛭為棒紋牛蛭或日本類蛭時，該稀釋的倍數(shù)為約10倍。

27、進一步地，該凝膠電泳的方法包括如下步驟：

28、(a)向該供試品溶液中加入蛋白上樣緩沖液，混勻，煮沸使蛋白變性，離心，得到待測液；

29、(b)安裝灌膠裝置，配制分離膠溶液和濃縮膠溶液，灌膠，得到凝膠板；

30、(c)向電泳槽外槽加入電極緩沖液，將該凝膠板轉(zhuǎn)移至電泳槽，向電泳槽內(nèi)槽加滿電極緩沖液，拔掉電泳梳，將電泳marker和該待測液分別上樣；

31、(d)采用第一恒壓垂直電泳，當指示前沿達到分離膠時更換為第二恒壓垂直電泳，當該指示前沿達到凝膠板底部時停止電泳，取出凝膠；

32、(e)向該凝膠中加入染液進行染色，得到染色凝膠；以及

33、(f)向該染色凝膠中加入脫色液，脫色至條帶清晰，得到電泳凝膠。

34、進一步地，該凝膠成像分析的方法包括：采用凝膠成像分析儀對該電泳凝膠進行掃描，將掃描結(jié)果采用gel-proanalyzer軟件分析，得到該待測蛭樣品凝膠電泳圖譜和該螞蟥凝膠電泳圖譜。

35、進一步地，在步驟(a)中，該供試品溶液與該蛋白上樣緩沖液的體積之比值為3～5，例如約4。

36、進一步地，在步驟(a)中，該煮沸的溫度為100℃。

37、進一步地，在步驟(a)中，該煮沸的時間為1～10min，例如約5min。

38、進一步地，在步驟(a)中，該離心的轉(zhuǎn)速為10000～15000r/min，例如約12000r/min。

39、進一步地，在步驟(a)中，該離心的時間為1～10min，例如約5min。

40、進一步地，在步驟(b)中，該分離膠溶液包括水、30％丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液、1.5m?tris、10％sds、10％aps和temed。

41、進一步地，在該分離膠溶液中，該水、該30％丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液、該1.5m?tris、該10％sds、該10％aps和該temed的體積之比為約800：約1000：約650：約25：約25：約1。

42、進一步地，在步驟(b)中，該濃縮膠溶液包括水、30％丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液、1.0m?tris、10％sds、10％aps和temed。

43、進一步地，在該濃縮膠溶液中，該水、該30％丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液、該1.0m?tris、該10％sds、該10％aps和該temed的體積之比為約700：約165：約125：約10：約10：約1。

44、進一步地，在步驟(b)中，該灌膠的方法包括：向該灌膠裝置一側(cè)加入該分離膠溶液至距離該灌膠裝置上端1.5～2cm處，加入無水乙醇封頂，室溫放置約30min，去除無水乙醇，繼續(xù)向該灌膠裝置一側(cè)加入該濃縮膠溶液至封頂，插入電泳梳，室溫放置約30min，得到該凝膠板。

45、進一步地，在步驟(c)中，該電極緩沖液的制備方法為：稱取適量的甘氨酸、tris、sds，加入水定容，稀釋約10倍，得到該電極緩沖液。

46、進一步地，該甘氨酸的質(zhì)量為100～200g，例如約144g。

47、進一步地，該tris的質(zhì)量為20～40g，例如約30g。

48、進一步地，該sds的質(zhì)量為5～15g，例如約10g。

49、進一步地，該定容的體積為800～1200ml，例如約1000ml。

50、進一步地，在步驟(c)中，該電泳marker的上樣體積為1～10μl，例如約5μl。

51、進一步地，在步驟(c)中，該待測液的上樣體積為5～15μl，例如約10μl。

52、進一步地，在步驟(d)中，該第一恒壓為70～90v，例如約80v。

53、進一步地，在步驟(d)中，該第二恒壓為110～130v，例如約120v。

54、進一步地，在步驟(e)中，該染液為考馬斯亮藍染液。

55、進一步地，在步驟(e)中，該染色在搖床上進行。

56、進一步地，在步驟(e)中，該染色的時間為30～60min，例如約40min。

57、進一步地，在步驟(f)中，該脫色液為由甲醇、冰醋酸和水組成的混合溶液。

58、進一步地，在該混合溶液中，該甲醇、該冰醋酸和該水的體積之比為(2～4)：(0.5～2)：(4～8)。

59、進一步地，在該混合溶液中，該甲醇、該冰醋酸和該水的體積之比為約3：約1：約6。

60、進一步地，該30％丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液的制備方法包括：稱取適量的丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺，加水稀釋至約50ml，即得。

61、進一步地，該丙烯酰胺的質(zhì)量為10～20g，例如約14.55g。

62、進一步地，該甲叉丙烯酰胺的質(zhì)量為0.1～1.0g，例如約0.45g。

63、進一步地，該1.5m?tris的制備方法包括：稱取適量的tris，加入第一次水溶解，加入鹽酸調(diào)節(jié)ph，再次加入水定容至約250ml，即得。

64、進一步地，該tris的質(zhì)量為30～60g，例如約45.4g。

65、進一步地，該第一次水的體積為200～300ml，例如約220ml。

66、進一步地，該調(diào)節(jié)ph為調(diào)節(jié)ph至約8.8。

67、進一步地，該1.0m?tris的制備方法包括：稱取適量的tris，加入第一次水溶解，加入鹽酸調(diào)節(jié)ph，再次加入水定容至約250ml，即得。

68、進一步地，該tris的質(zhì)量為20～40g，例如約30.3g。

69、進一步地，該第一次水的體積為200～300ml，例如約220ml。

70、進一步地，該調(diào)節(jié)ph為調(diào)節(jié)ph至約6.8。

71、進一步地，該10％aps的制備方法包括：稱取適量的aps，加入水稀釋，即得。

72、進一步地，該aps的質(zhì)量為0.5～2g，例如約1g。

73、進一步地，該水的體積為5～20ml，例如約10ml。

74、進一步地，該10％sds的制備方法包括：稱取適量的sds，加入水稀釋，即得。

75、進一步地，該sds的質(zhì)量為1～10g，例如約5g。

76、進一步地，該水的體積為40～60ml，例如約50ml。

77、進一步地，該對比結(jié)果包括以下的任何一種：

78、(1)如果該待測蛭樣品凝膠電泳圖譜與螞蟥對照藥材凝膠電泳圖譜一致或相似，例如待測蛭樣品凝膠電泳圖譜位于25～34kda、17～25kda和11kda呈現(xiàn)三個條帶，則該待測蛭為螞蟥；

79、(2)如果該待測蛭樣品凝膠電泳圖譜與水蛭對照藥材凝膠電泳圖譜或菲牛蛭對照藥材凝膠電泳圖譜一致或相似，例如待測蛭樣品凝膠電泳圖譜位于60～75kda和25～34kda呈現(xiàn)兩個條帶，且位于11kda呈現(xiàn)兩個條帶，則該待測蛭為水蛭或菲牛蛭；

80、(3)如果該待測蛭樣品凝膠電泳圖譜與棒紋牛蛭對照藥材凝膠電泳圖譜一致或相似，例如待測蛭樣品凝膠電泳圖譜位于60～75kda、25～34kda、17～25kda和11kda呈現(xiàn)四個條帶，則該待測蛭為棒紋牛蛭；

81、(4)如果該待測蛭樣品凝膠電泳圖譜與日本類蛭對照藥材凝膠電泳圖譜一致或相似，例如待測蛭樣品凝膠電泳圖譜位于25～34kda和11kda呈現(xiàn)兩個條帶，則該待測蛭為日本類蛭；

82、(5)如果該待測蛭樣品凝膠電泳圖譜與上述對照藥材凝膠電泳圖譜均不一致或不相似，則該待測蛭為其他混偽品。

83、根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種上述鑒別方法在相互區(qū)分水蛭、螞蟥和/或其近緣混偽品中的用途，其中該近緣混偽品選自以下的一種或多種：菲牛蛭、棒紋牛蛭、日本類蛭和其他混偽品。

84、本發(fā)明的有益效果：

85、本發(fā)明通過將樣品進行鹽水浸提、電泳分析，即可根據(jù)凝膠上蛋白條帶的數(shù)目和位置對待檢測樣品進行鑒別，檢測結(jié)果直觀、準確、易鑒別。